应斌武教授-结核病的分子诊断技术进展.pdf

《应斌武教授-结核病的分子诊断技术进展.pdf》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、结核病的分子诊断技术进展应斌武四川大学华西医院2017.12广西南宁01结核的流行现状02结核的分子生物学诊断03诊断技术发展的多元化华西医院的结核病诊断04的临床应用与研究进展一、结核流行病学现状预计未来20年将有3600万人死于结核病，结核病为感染性疾病中的头号杀手。传统检测方法特点：操作简便、快速、价廉。特异性好，阳性率低，易造成漏诊。涂片特点：提高了镜检的灵敏度，缩短了检测时间；缺点是假阳性率较高，需确证方法（萋-纳染色）Sputum固体培养及药敏试验—孵育4周观察生长情况平均时间2-3个月培养液体培养及药敏试验平均时间20天数小时，快速简便，分子生物学相

2、对传统方法更灵敏二、结核的分子生物学诊断分子诊断RNA水平DNA水平蛋白质水平恒温扩增变温扩增IGRA,TST等扩增杂交SAT,TMAFISH,探针鉴定鉴定+耐药LAMP,RT-PCR,SDALPA,Xpert,HRM,测序RNA作为分子诊断靶标的技术1.GenProbeMTD（TMA技术）原理：以rRNA为靶标，采用线性探针技术检测结核分枝杆菌复合群检测时间:2.5h扩增rRNA，TMA恒温扩增动力快速反应，30分钟产生十亿扩增物反应在单一试管进行，无须移液和清洗产物为易自然降解RNA，防止交叉污染唯一获得FDA推荐的涂阴样本快速检测技术，不使用PCR仪

3、，无需专业PCR实验室认证RNA作为分子诊断靶标的技术2.恒温扩增检测SAT技术DNA作为分子诊断靶标的技术1.TB-DNA检测1.能稳定检测10copy的TB-DNA，较评价灵敏特异2.荧光定量PCR检出MTB阳性率显著高1.TB-DNA检测的限制步骤在于DNA的提取：磁珠法提取DNA较煮沸裂解法和柱子法纯度于涂片染色和培养法高3.早期、快速、准确地诊断结核病2.TB-DNA检测尤其适合于菌量少的体液标痰液、支气管灌洗液——肺结核本血液——播散性结核和各脏器结核病3.血液标本除外，MTB检出率极低，可能和脑脊液——中枢神经系统结核病前处理、核酸提取有关宫颈/尿道

4、拭子——泌尿生殖结核DuoL,YingB,etal.Molecularprofileofdrugresistanceintuberculousmeningitisfromsouthwestchina.ClinInfectDis.2011Dec;53(11):1067-73.DNA作为分子诊断靶标的技术2.环介导恒温扩增LAMP技术原理针对靶基因的6个区域设计4条特异引物，利用链置换DNA聚合酶在等温条件(63-65℃)下30-60min，即可完成核酸扩增特点不需双链DNA先变性成单链扩增反应在等温下可持续进行扩增效率高，15min-1h内实现109-1010

5、倍的扩增对DNA的扩增不需要热循环仪器。当模板为RNA时，仅需加入逆转录酶即可与DNA一样扩增基于TB-DNA的MTB鉴定及分子药敏技术1.Lineprobeassays线性探针测定法Hain（LPAGenoType®MTBDRplus/Rsl）技术2h0.5h2.5-3hWHO建议使用Hain来检测MDR-TB基于TB-DNA的MTB鉴定及分子药敏技术2.XpertMTB/RIF以半巢式实时定量PCR扩增技术为基础，能够自动抽提DNA并且扩增rpoB基因。设计五个重叠的分子信标，检测81碱基rpoB核心区域所有可能的突变；用不同的荧光基团标记每个分子信标，

6、仅在一个反应中完成整个检测2小时内直接从病人痰液中检测是否有MTB及对利福平的耐药性整个过程都在一密闭环境中进行，手动操作时间不超过5分钟，对操作者和周围环境安全2010年12月，WHO首次发布官方文件推荐XpertMTB/RIF技术的使用2013年，WHO又再次发文更新了对XpertMTB/RIF的推荐意见：当成人和儿童患者怀疑MDR-TB感染或合并HIV感染时，强烈推荐XpertMTB/RIF作为首选检测方法，从而替代传统的涂片镜检，培养和药物试验的方法。截止到2014年末，GeneXpert已累积生产了对疑似肺外结核患者的肺外标本如脑脊液，17,88

7、3组模块和10,013,600淋巴结和其它组织，推荐XpertMTB/RIF作组标本盒，销往145个国家和为检测方法。地区。对于痰涂片检测阴性的患者，推荐XpertMTB/RIF作为后续检测方法。GeneXpert残留物进行其它耐药性分析Xpert测定法处理的样品残留物可用于PCR，以发现与MDR和XDR-TB的其他药物的抗性相关的突变，无需培养或生物安全基础设施，特别适合于不可能进行表型药物敏感性测试的环境NeweriterationsofGeneXpertXpertMTB/RIFUltra手动操作时间：<1分钟结果：<80分钟敏感性更高，特别是涂片阴性

8、结核病例