行业标准：GBT 28094-2011 芒果细菌性黑斑病菌检疫鉴定方法.pdf

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1、ICS65．020．01B16囝园中华人民共和国国家标准GB／T28094--2011芒果细菌性黑斑病菌检疫鉴定方法DetectionandidentificationofXanthomonascampestrispv．mnngi，PrnPindfcnP(Pateleta1．)Robbseta1．2011—12-30发布2012—06-01实施宰瞀鹛紫瓣警矬瞥星发布中国国家标准化管理委员会“⋯刖罱GB／T28094—2011本标准按照GB／T1．1—2009给出的规则起草。本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC／TC271)提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国天津出入境检

2、验检疫局、中华人民共和国广东出入境检验检疫局。本标准主要起草人：刘鹏、罗加凤、崔汝强、魏亚东、王金成、刘勇、赵立荣、黄国明。1范围芒果细菌性黑斑病菌检疫鉴定方法GB／T28094--2011本标准规定了芒果细菌性黑斑病菌的检疫鉴定方法。本标准适用于芒果果实、苗木等植物材料中芒果细菌性黑斑病菌的检疫和鉴定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。SN／T1193基因检验实验室技术要求SN／T2122进出境植物及植物产品检疫抽样3芒果细菌性黑斑病菌基本信息中

3、文名：芒果细菌性黑斑病菌。学名：Xanthomonascampestrispv．mangireraeindicae(Patel，Moniz＆‘Kulkarni1948)RobbsRibeiro＆Kimura1974。病害英文名：mangobacterialblackspot。属细菌界Bacteria，变形细菌门Proteobacteria，7-变形细菌纲Gammaproteobacteria，黄单胞菌目Xanthomonodales，黄单胞菌科Xanthomonodaceae，黄单胞菌属Xanthomonas。病菌潜伏在病叶、病枝条、病果等组织内越冬，是主要的初侵染源。病菌借风雨、流

4、水和接触传播，远距离传播主要是带菌苗木、接穗和果实等。芒果细菌性黑斑病菌的其他信息参见附录A。4方法原理依据症状特征，以及该病菌的生物学特性、生理生化特性、分子生物学特性和致病性特征等进行检测鉴定。5仪器用具生物显微镜、超净工作台、高压灭菌器、恒温培养箱、离心机(12000r／min)、分光光度计、PCR仪、电泳仪、凝胶成像仪、电子天平(感量0．0001g)、恒温水浴锅、恒温光照培养箱、低温冰箱、微量可调加样器(10pL、100肛L、200tLL、1000ktL)等。6试剂和培养基6．1试剂MgCI：，dNTPs(dATP、dTTP、dCTP、dGTP)，Taq酶，氧化酶试纸条，细菌

5、微量生化鉴定管，引物1GB／T28094--2011XgyrconpcrFl，Xgyrconrpcrl，Xgyrconfspl等购自生物公司。除另有规定外，所有试剂均为分析纯，所有试验用水均为灭菌双蒸水。6．2培养基NA培养基，半选择性培养基NCTM3和KC见附录B。7检疫鉴定方法及步骤7．1现场检疫芒果种植园的病害调查或进出境芒果样品的现场检疫中，若芒果植株或果实病害症状表现与附录A中描述类似，取样带回实验室做进一步分离鉴定，取样方法和步骤参照SN／T2122。7．2病原菌分离选择较新鲜的发病组织，切取病健交界部位，用无菌水清洗三次。在培养皿中滴人几滴无菌水，将病组织放入无菌水中，

6、并用灭菌玻棒研碎，10min后用接种环蘸取，在半选择性培养基NCTM3或KC平板上划线分离，做不少于3个平板。置于28℃下，NCTM3培养基培养5d～6d，KC培养基培养4d～5d后观察。Xcm在这两种培养基上菌落特征相似，直径3mm～4mm，圆形，轻微凸起，边缘整齐，白色或乳白色(少见黄色)，黏液状。挑取可疑单菌落点接在氧化酶试纸条上，选择60s内不变色的单菌落(排除假单胞菌)在NA培养基上进行分离纯化。7．3分子生物学鉴定(PCR方法)分子生物学检测中安全措施方面要求按照SN／T1193。纯化后的菌株经28℃培养24h后，制备模板DNA，扩增gyrB基因，用无菌双蒸水代替模板做空

7、白对照，扩增目的片段大小约为700bp。PCR产物回收后测序，测序结果与GenBank数据库中的已知模式菌株序列进行比对，该检测方法见附录B。7．4生化指标测定采用生化鉴定管对可疑菌株和芒果细菌性黑斑病菌标准菌株进行下列指标的检测，包括硝酸盐还原，七叶灵水解，尿酶产生，H：S产生，淀粉水解，明胶液化，阿拉伯糖、纤维二糖、半乳糖和果糖发酵，吲哚产生，精氨酸双水解。Xcm生化指标检测结果应为硝酸盐还原阴性，七叶灵水解阳性，H：S产生阳性，淀粉水解阳性，明胶液化