行业标准：GBT 28082-2011 榆枯萎病菌检疫鉴定方法.pdf

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1、ICS65．020．01B16圆园中华人民共和国国家标准GB／T28082--2011榆枯萎病菌检疫鉴定方法DetectionandidentificationofOphiostomanovo—ulmiBrasierandOphiostomaulmi(Buisman)Nannf．2011-12-30发布2012-06-01实施宰瞀鹊紫瓣訾糌瞥星发布中国国家标准化管理委员会况19刖蟊本标准按照GB／T1．1—2009给出的规刘起草。本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC／TC271)提出并归口。本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院。本标准主要起草人：吴

2、品珊、严进、杜洪忠。GB／T28082--20111范围榆枯萎病菌检疫鉴定方法GB／T28082--2011本标准规定了榆枯萎病菌的分离培养、形态学鉴定的方法。本标准适用于来自榆枯萎病菌有发生国家和地区的榆属(UlmusL．)苗木、原木、木制品和木包装中榆枯萎病菌的检疫鉴定。2榆枯萎病菌基本信息中文名：榆枯萎病菌。学名：Ophiostomano∞一ulmiBrasier；Ophiostomaulmi(Buisman)Nannf．。异名：Ceratocystisulmi(Buism．)Moreau。病害英文名：dutchelmdisease，elmwiltdi

3、sease。属真菌界Fungi，子囊菌门Ascomyeota，子囊菌纲Ascomycetes，粪科菌亚纲Sordariomyeetidae，长噱壳目Ophiostomatales，长喙壳科Ophiostomataeeae，长喙壳属Ophiostoma。榆枯萎病菌其他信息参见附录A。3方法原理依据无性孢子和有性世代的形态特征和生物学特性，以及其对寄主造成的症状特征进行检测鉴定。4仪器4．1生物显微镜。4．2体视显微镜。4．3光照生物培养箱。4．4高压灭菌器。4．5超净工作台。4．6电子天平。4．7摇床。5试剂和培养基5．1试剂琼脂粉，麦芽膏，Oxoid麦芽提取

4、物，榆树枝条，葡萄糖，天门冬酰胺(L-asparagine)，磷酸二氢钾(KH。POt)，硫酸镁(MgSO。·7H：O)，硫酸锌(ZnSO^)，三氯化铁(FeCl。)，维生素B。，维生素风，放线茵酮，链霉素，青霉素。洼：放线菌酮为剧毒品，注意防护。1GB／T28082--20115．2培养基5．2．1选择性培养基0．2g放线菌酮溶于100mL水，取50mL加于1000mL麦芽膏(MA)培养基内，灭菌后冷至45℃，加入10mL含1％链霉素和1％青霉素的混合液。5．2．2麦芽膏培养基MA25g麦芽膏，17g琼脂粉，1000mL蒸馏水，灭菌。5．2．3榆边材培养基

5、ESA取50g健康的榆树边材或枝条，去皮粉碎成直径0．5em的小块，15g琼脂粉，500mL蒸馏水，灭菌。5．2．4Tchernoff改良培养液20g葡萄糖、2g天门冬酰胺、1．5g磷酸二氢钾、lg硫酸镁、20mg硫酸锌、10mg三氯化铁、1mg维生素B1和1mg维生素B6，1000mL蒸馏水，灭菌。5．2．5Oxoid麦芽提取物培养基MEA33gOxoid麦芽提取物，10g琼脂粉，1000mL蒸馏水，灭菌。6标准菌株Ophiostomanovo-ulmiA交配型(Amatingtype)，雌性；B交配型(Bmatingtype)，雄性。Ophiostoma

6、ulmiA交配型(Amatingtype)，雌性；B交配型(Bmatingtype)，雄性。中国检验检疫科学院保存病菌的标准菌株。7检测检查苗木、原木或木材的表面，纵向和横向切开树干或枝条检查。榆枯萎病菌的2个种引起的外观症状是相同的。在树干或枝条的横切面上，可见靠近外面的年轮附近有深褐色斑点或条纹，有时斑点密集，可连成断续的深褐色圆环。去掉树皮，木质部上有深褐色纵向条纹，有时条纹不明显，可轻削一层木质，条纹便显现出来。切开枝权处，常可找到小蠹的蛀食槽。取有如下症状的样品做病菌分离：干枯呈深褐色的枝条，有小蠹蛀食槽痕迹的树皮，横断面上有深褐色斑点或断续的褐色

7、圆环枝干，纵切面有褐色条纹枝干，货物上附着有小蠹虫。8鉴定8．1分离培养对变色的木质部，去掉树皮，切取直径为5mm大小，于选择性培养基(见5．2．1)上，20℃黑暗培养；对有虫蛀槽的树皮，清除蛀槽内的虫粪和残屑，70％酒精消毒10s～30S，无菌水冲洗，灭菌滤纸吸干水分，切取边长为5mm～10mm的大小，于选择性培养基上，20℃黑暗培养；小蠹虫解肢为5mm大小，70％酒精消毒10s～30S，无菌水冲洗，灭菌滤纸吸干水分，于选择性培养基上，20℃黑暗培养。一2GB／T28082--2011旦有真菌菌落出现，立即分别转皿。转皿到ESA培养基，zo℃培养，以期获得

8、粘柬梗霉Pesotumulmi；转接于Tcherno