行业标准：GBT 28078-2011 水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌检疫鉴定方法.pdf

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1、ICS65．020．01B16a亘中华人民共和国国家标准GB／T28078--2011水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌检疫鉴定方法DetectionandidentificationofXanthomonasoryzaepv．oryzae(Ishiyama)Swingseta1．、Xanthomonasoryzaepv．oryzicola(Fangeta1．)Swingseta1．2011—12—30发布2012—06—01实施宰瞀鹊鬻瓣警矬瞥星发布中国国家标准化管理委员会“”。刖昌GB／T28078--2011本

2、标准按照GB／T1．12009给出的规则起草。本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC／TC271)提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国湖南出入境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国厦门出入境检验检疫局。本标准主要起草人：朱金国、赵文军、唐连飞、朱水芳、莫瑾、彭梓、陈红运、钟文英。1范围水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌检疫鉴定方法GB／T28078—2011本标准规定了水稻种子和其他水稻材料的水稻白叶枯病菌Xanthomonasoryzaepv．oryzae(Xoo)和水稻细菌性条斑病菌Xa

3、nthomonasoryzaepv．oryzicola(Xcola)的检疫鉴定以植物的形态学特征、生理生化特性、分子生物学和酶联免疫学技术作为依据，明确了田问观察、分离鉴定、样品保存的方法。本标准适用于水稻材料和相关环境中水稻自叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌的检测。2规范性§f用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注El期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB15569--1995农业植物词运检疫规程ISTA国际种子检验规程3方法原理根

4、据水稻植株的形态学特征进行田问观察，并采用分离培养、分子生物学和酶联免疫学筛选、生理生化鉴定以及致病性测定对植株材料上的水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌进行判定。4设备和材料4．1冷冻高速离心机：转速≤15000r／rain。4．2PCR扩增仪。4．3恒温培养箱：28℃±1℃。4．4显微镜：物镜头10×～100×。4．5天平：精度0．001g。4．6高压灭菌器。4．7均质器：转速4000r／min～8000r／rain。4．8可调移液器：0．2pL～1pL，1pL～lopL，10pL～100pL，100pL～100

5、0肛L。4，9器具：灭菌的镊子、剪刀，称量勺。4．10吸管：1mL、10mL。4．11灭菌平皿：直径90mm，玻璃或一次性塑料平皿。4．12三角瓶：i00mL。5培养基和试稠5．1SPA培养基：见A．1。GB／T28078--20115．20．001％吐温20一磷酸盐缓冲液。5．3革兰氏染色试剂：见A．2。5．4鞭毛染色试剂：见A．3。5．5明胶液化培养基：见A．4。5．6氧化酶试剂：见A．5。5．7硝酸盐培养基：见A．6。5．8过氧化氢酶试验试剂：见A．7。5．9石蕊牛乳试剂：见A．8。5．10糖氧化和发酵测定培养

6、基：见A．9。5．11碳源利用试验培养基：见A．10。5．12水杨苷产酸试验培养基：见A．1l。5．132，3，5-三苯基氯化四氮唑(TTC)。6田问检验水稻在整个生育期的叶片均可受害，在苗期、分蘖期受害最重，通过田间观察可直接对水稻受害情况进行判断，水稻细菌性条斑病菌和水稻白叶枯病菌田间症状及相关资料参见附录B和附录c。对田间检验有病害发生的植株，按以下操作进行抽样及实验室检验。7抽样水稻种子抽样可参照IsTA《国际种子检验规程》或者GP,15569--19956．1方法进行。8样品处理8．1水稻种子大量种子样品通

7、常需先用蒸馏水冲洗以除去残片和表面的污染杂茵，以避免杂菌太多产生干扰。清洗后称取10g或400粒种子，放人0．001％吐温一磷酸缓冲液中低温(5℃～15℃)浸泡4h～6h，用均质器打碎，制备样品提取液。如果是检测少量的种子样品，取20粒种子加入i0mL灭菌的磷酸缓冲液，用灭菌槌和研钵或是搅拌器将种子完全压碎制成提取液。将样品提取液于22℃～25℃环境中放置4h～6h。旋涡混匀悬浮液5min，制备10×、i00×和1000×三个稀释度的悬浮液，从原液及每个梯度稀释液中取0．3mL，分别放人到3个SPA的平皿中(每个平皿

8、加入0．1mL)。用L-型玻璃棒将液体均匀涂布在SPA琼脂的表面。若提取液杂菌较多，可考虑增加稀释梯度和接种平板的数量以提高检出率。8．2植物组织材料8．2．1无症状的组织可将10g左右样品直接放人90mL0．001％吐温一磷酸盐缓冲液中，均质imin制备成样品提取液。按8．1方法进行稀释与涂布。8．2．2未显症的可疑组织用灭菌的剪刀剪成小块，