行业标准：GBT 28068-2011 柑桔溃疡病菌实时荧光PCR检测方法.pdf

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1、ICS65．020．01B16a亘中华人民共和国国家标准GB／T28068--2011柑桔溃疡病菌实时荧光PCR检测方法DetectionofXanthomonascitrisubsp．citriusingthereal—timefluorescentPCR2011-12-30发布2012-06-01实施丰瞀徽鬻瓣警糌瞥篓发布中国国家标准化管理委员会促19前言GB／T28068--2011本标准按照GB／T1．1—2009给出的规则起草。本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC／TC271)提出并归口。本标准起草单位：重庆大学、农业部农

2、业技术推广服务中心、中华人民共和国北京出入境检验检疫局。本标准主要起草人：王中康、殷幼平、王福祥、高文娜、夏玉先、李正国、曹月青。1范围柑桔溃疡病菌实时荧光PCR检测方法GB／T28068--2011本标准规定了柑桔溃疡病菌(Xanthomonascirrisubsp．cirri，Xcc)的实时荧光PCR检测的样品制备、检测技术、操作方法及结果判定标准。本标准适用于柑桔植物材料中柑桔溃疡病菌的实时荧光PCR检测和病害鉴定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引

3、用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB5040柑桔苗木产地检疫规程GB／T19495．2转基因产品检测实验室技术要求3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3．1柑桔溃疡病citruscankerdisease由柑桔溃疡病菌引起的国内外柑桔检疫性细菌病害。症状特征表现为柑桔叶片、枝条和果实表面出现隆起的木栓化溃疡病斑，造成柑桔落叶落果、树势衰弱，严重影响柑桔产量与果品外观质量。3．2柑桔溃疡病菌Xanthomonuscitrisubsp．cirri指引起亚洲型柑桔溃疡病的病原细菌，为黄单胞菌属的柑桔黄单胞柑桔亚种新组合(S

4、chaad2006；Young2008)。3．3实时荧光PCRreal-timefluorescentPCR实时荧光聚合酶链式反应，一种在体外扩增微量的特殊DNA片段的方法，在扩增过程中由于荧光物质的释放并被实时检测而能够快速、灵敏地检出模板DNA的存在。3．4扩增引物primer人工合成的寡核苷酸序列，其序列与待扩增的目标DNA序列中的一段相同，用于引导DNA体外扩增。3．5扩增模板templetDNA体外扩增中所用的待扩增的靶标序列。3．6Ct值cyclethresholdvalue实时荧光PCR反应中每个反应管内的荧光信号达到设定阈值

5、时所经历的循环数。GB／T28068--20113．7柑桔溃疡病菌重组质粒利用特异性引物扩增柑桔溃疡病菌(Xanthomonascirrisubsp．citri)基因组模板，获得的柑桔溃疡菌特异性DNA扩增序列构建重组质粒，将该重组质粒转导到大肠杆菌JM109菌株中繁殖培养后，重新提取出获得的质粒DNA。用于作为柑桔溃疡病菌检测的阳性对照。4柑桔溃疡病菌基本信息拉丁学名：柑桔黄单胞茵柑桔亚种Xanthomonascitrisubsp．citriGabrielet．al(1989)。病害名称：柑桔溃疡病citruscancerdisease。

6、分类地位：假单胞菌科Pseudomonaceae、黄单胞菌属Xanthomonas，柑桔黄单胞Xanthomonascitri[Gabrielet．al(1989)]。主要分布于亚洲的中国，印度和东南亚，美洲的美国、巴西、乌拉圭、巴拉圭和阿根廷等国家和地区。葡萄柚、甜橙、柠檬、莱檬、柑桔和枳等柑桔种和品种。带菌种苗、接穗及商品果实是远距离传播的主要途径；田间则主要由夹风雨和农事操作传播。柑桔溃疡病菌其他信息参见附录A。利用柑桔溃疡病菌亚种通用引物对XccF05／XccR05，以常规PCR方法可以检测出柑桔材料中柑桔黄单胞柑桔亚种(A菌系)和

7、褐色黄单胞莱檬亚种(BC／D菌系)(检测引物、检测方法及结果判定参见附录B)。5方法原理本标准采用的实时荧光PCR检测包括了荧光染料法和荧光探针法两种检测方法。其原理是，利用病菌特有DNA序列设计引物，在PCR扩增时加入荧光染料，荧光染料与扩增形成的产物一DNA双链结合而发出荧光被检测器实时检测(荧光染料法)，或在合成特异性引物的同时合成一条特异性的荧光双标记探针，探针5’端和3’端分别标记荧光素报告基团和淬灭基团，如果反应体系中存在待测目标DNA模板，引物和探针则与模板上的序列配对而特异性结合，当PCR扩增延伸到探针结合部位时，TaqDN

8、A聚合酶将探针水解成单核苷酸，使标记在探针上的报告基团游离出来并发出荧光信号被检测器实时检测(荧光探针法)。由于初始模板量的不同，反应管内的荧光物质达到设定的可检测阈值时所经历的