行业标准：GBT 28067-2011 甘蔗黄叶病毒实时荧光RT-PCR检测方法.pdf

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1、ICS65．020．01B16a雪中华人民共和国国家标准GB／T28067—2011甘蔗黄叶病毒实时荧光RT-PCR检测方法Detectionofsugarcaneyellowleafvirususingthereal·。timeRT__PCR2011-12-30发布2012-06-01实施宰瞀髁紫瓣訾辫瞥星发布中国国家标准化管理委员会况1”刖声GB／T28067--2011本标准按照GB／T1．1—2009给出的规则起草。本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC／TC271)提出并归口。本标准起草单位：福建农林大学甘蔗综合研究所、农业部甘蔗及制品质量监

2、督检验测试中心、农业部甘蔗遗传改良重点开放实验室。本标准主要起草人：高三基、陈平华、陈如凯、郭晋隆、张华、许莉萍、王恒波、陈由强。1范围甘蔗黄叶病毒实时荧光RT-PCR检测方法GB／T28067--2011本标准规定了甘蔗黄叶病毒实时荧光RToPCR检测方法所需的仪器与试剂、样品的采集与前处理、操作方法以及结果判定。本标准适用于甘蔗植株、种苗及种茎中甘蔗黄叶病毒的快速检测、诊断。2术语和定义2．12．22．3下列术语和定义适用于本文件。反转录reversetranscription以RNA为模板合成DNA的过程，也称逆转录。实时荧光RT-PCRrealtim

3、eRT-PCR实时荧光反转录一聚合酶链式反应。ct值cycletime每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。3缩略语下列缩略语适用于本文件。RNA：核糖核酸Taq酶：TaqDNA聚合酶dNTPs：4种脱氧核苷5，．三磷酸混合液RNase：RNA酶M-MLV：莫洛尼鼠白血病病毒(Moloneymurineleukeminvirus)反转录酶FAM：6-羧基荧光素TAMRA：6-羧基四甲基罗丹明4方法原理在反转录酶作用下将RNA反转录成cDNA，再以cDNA为模板利用Taq酶进行实时荧光PCR扩增反应(采用TaqMan探针方法)。在比对甘蔗黄叶病

4、毒外壳蛋白基因的基础上，设计一对仅在甘蔗黄叶病毒外壳蛋白基因间保守的特异性引物和一条特异性的荧光双标记探针。探针的5’端标记FAM荧光素为报告荧光基团，3’端标记TAMRA荧光素为淬灭荧光基团，结合部位位于目的扩增片段内部。当完整的探针与目的序列配对时，荧光基团发射的荧光因与3’端的淬灭剂接近而被淬灭，仪器检测不到荧光信号；但在进行延伸反应时，Taq酶发挥5’一3’的外切核酸酶功能，将探针降解，使得荧光基团】GB／T28067—2011与淬灭剂分离，所发出的荧光不再为淬灭剂所吸收而被检测仪所接受。随着扩增循环数的增加，释放出来的荧光基团不断积累。因此荧光强度

5、与扩增产物的数量呈正比关系。5甘蔗黄叶病毒基本信息5．1病毒粒体形态特征甘蔗黄叶病毒粒体为二十面对称体，直径24nm～29nm，浮力密度1．30g／em3，由蛋白质外壳及其包裹着的一条单链、正义的RNA(ssRNA)构成，病毒基因组大小约6kb。5．2寄主范围自然寄主为甘蔗属中的热带种(Saccharumofficinarum)、大茎野生种(Saccharumrobustum)、中国种(Saccharumslnensis)和割手密(Saccharumspontaneum)。实验寄主包括蔗茅属(Erianthussp．)、小麦、燕麦、大麦、水稻、玉米和高粱等。

6、在寄主植株内的分布主要局限于组织韧皮部内。5．3寄主症状田间病症表现为甘蔗叶片中脉黄化，并向两侧扩展，中脉下表皮为鲜黄色，上表皮仍是正常的白色或绿白色，有的染病品种叶片中脉两侧出现红褐色。染病植株叶片从叶尖开始干枯坏死，并向下扩展，严重感病植株叶片发黄、坏死。由甘蔗黄叶病毒引起的这种病害称为甘蔗黄叶病(Sugarcaneyellowleafdisease)，早期称为甘蔗黄叶综合症(sugarcaneyellowleafsyndrome)。5．4分布地区甘蔗黄叶病1989年首次发生在美国夏威夷，随后陆续在美国的弗罗里达州、德克萨斯州、路易斯安那州以及巴西、澳大

7、利亚、南非、中国、印度等30多个国家和地区出现并不断蔓延扩大。5．5传播途径由甘蔗蚜虫(Melanaphissacchari)、甘蔗绵蚜(Ceratovacunalanigera)、玉米叶蚜(Rhopalosiphummaidis)和水稻根际蚜虫(Rhopalosiphumrufiabdominalis)传播，也可由感病的种茎传播，但不能通过种子、机械摩擦方式传播。6病毒的分类信息国际病毒分类委员会(ICTV)第8次报告将甘蔗黄叶病毒列入黄症病毒科(Luteoviridae)马铃薯卷叶病毒属(Polerovirus)中成员，英文名称为sugarcaneyel

8、lowleafvirus，缩写为SCYLV。7仪器与