行业标准：GBT 28066-2011 丁香假单胞杆菌豌豆致病型检疫鉴定方法.pdf

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1、ICS65．020．01B16a园中华人民共和国国家标准GB／T28066--2011丁香假单胞杆菌豌豆致病型检疫鉴定方法DetectionandidentificationofPseudomonassyringaepv．pisi(Sackett)Youngeta1．2011—12-30发布2012-06-01实施宰瞀鳃紫瓣警麟瞥星发布中国国家标准化管理委员会仅19刚青GB／T28066--2011本标准按照GB／T1，1—2009给出的规则起草。本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC／TC271)提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国厦门出入境检验检疫局、中华人民共

2、和国上海出入境检验检疫局。本标准主要起草人：林石明、黄蓬英、易建平、陈青、廖富荣、吴媛、陈红运、王宏毅。1范围丁香假单胞杆菌豌豆致病型检疫鉴定方法GB／T28066--2011本标准规定了丁香假单胞杆菌豌豆致病型生物学、血清学及分子生物学的检测鉴定方法。本标准适用于植物种子、苗木等植物及其产品中丁香假单胞杆菌豌豆致病型的检测和鉴定。2丁香假单胞杆菌豌豆致病型基本信息中文名：丁香假单胞杆菌豌豆致病型。中文别名：豌豆(细菌性)枯萎病菌或豌豆细菌性叶斑病菌、豌豆假单胞蔓枯病菌或茎枯病菌等。学名：PseudomonassyringaeVanHall，1902pv．pisi(Sacket

3、t，1916)Young，DyeandWilkie，1978。病害英文名：bactrialblightofpea。异名：Bacteiumpisi(Sackett)Smith，1920；Chlorobacterpisi(Sackett)Patel&Kulkarni，1951；PseudomonaspisiSackett，1916；PseudomonassyringaeVanHall，1902；Pytomonas(Sackett)Bergey，etaI．，1923。属原核生物界Procaryotes，变形细菌门Proteobacteria，7-变形细菌纲Gammaproteobac

4、teria，假单胞杆菌目Pseudomonadales，假单胞杆菌科Pseudomonadaceae，假单胞杆菌属Pseudomonas。丁香假单胞杆菌豌豆致病型的其他信息参见附录A。3方法原理依据病菌在培养基上生长的菌落形态、碳源的利用情况、基于抗原抗体反应的双抗夹心酶联免疫吸附测定(DAS-ELISA)、基于体外DNA扩增技术的聚合酶链式反应(PCR)，以及病菌接种后的致病特征等进行检测鉴定。4主要试剂本标准的检测鉴定方法主要使用以下试剂：硫酸镁、磷酸氢二钾、蔗糖、甘油、硼酸、氯化镁、蛋白胨、生理盐水、三氯甲烷、异戊醇、异丙醇、Tris一盐酸、EDTA、SDS(t二烷基硫酸

5、钠)、cTAB(十六烷基三甲基溴化胺)、溴化乙锭、头孢氨苄、万古霉素、头孢呋辛酸、溴酚蓝、放线(菌)酮或制霉菌素和PCR相关试剂。5主要仪器本标准的检测鉴定方法主要使用以下仪器：超净工作台、高压灭菌锅、显微镜、培养箱、电子天平、离心机、PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、BIOLOG微生物鉴定系统和酶标仪。1GB／T28066--20116病菌分离6．1种子样品的制备检查皱缩种子和其他为害状的种子。每份种子检测样品至少检测2000粒种子。将种子倒人5L桶内，加3L无菌水，搅拌，用无菌(新)的塑料袋严密封盖，4℃下静置16h～18h或过夜；去掉塑料袋，充分搅拌。取种子浸出液10mL，

6、用15000g离心5rain，用蒸馏水分2次(每次1mL)洗下沉淀物，制成种子浸出液，以备分离培养。6．2种子中病菌的分离培养取100“L的种子浸出液涂布于P3和(或)s4培养基平板上(培养基配制见附录B)。每个样品设3个～10个重复，无菌水作为空白对照。在25℃土2℃下黑暗中培养，3d后开始观察。如果在培养基上产生可疑菌落(菌落特征见表1)，则将菌落转移至KB平板上划线培养1d～2d进行纯化(培养基配制见附录B)，纯化3次后进行生化鉴定、DAS-ELISA或PCR等方法鉴定。表1培养基上的菌落特征P3培养基S4培养基Pspi的苗落扁平状，白色、透明．边缘不规则Pspi的菌落较

7、大，半球形，白色，边缘整齐多数菌株有蓝色荧光6．3植物组织中病菌的分离培养仔细检查植物叶片、豆荚等组织的症状(参见图A．1)，用无菌刀片将可疑的病斑切成细的切块，加一滴无菌水，置于载玻片上，盖上盖玻片后在显微镜下观察。如果观察到细菌的菌脓，则进行分离培养。选择新鲜症状的叶片、豆荚等组织，切取病斑前沿部分2mm～7mm的组织，用70％酒精表面消毒15s，无菌水洗2次～3次，在s4和(或)P3培养基平板上划线分离。在25℃士2℃下黑暗中培养3d后，开始观察。如果在培养基上产生可疑菌落(菌落特征见