行业标准:GBT 28065-2011 地中海实蝇生物芯片检测方法.pdf

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1、ICS65.020.01B16圆雷中华人民共和国国家标准GB/T28065--2011地中海实蝇生物芯片检测方法BiochipdetectionofCeratitiscapitata(Wiedemann)2011-12-30发布2012-06-01实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局借龠中国国家标准化管理委员会厘111刖置GB/T28065--2011本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。本标准起草单位:中华人民共

2、和国深圳出入境检验检疫局、中华人民共和国北京出入境检验检疫局,本元正阳基因有限公司、深圳市检验检疫科学研究院。本标准主要起草人:余道坚、李建光、任鲁风、徐浪、周琦、章桂明、陈枝楠、汪万春、康林、仲建忠、向才玉。1范围地中海实蝇生物芯片检测方法GB/T28065--2011本标准确定了地中海实蝇Ceratitiscapitata(Wiedemann)(双翅目Diptera实蝇科Tephritidae)的生物芯片制备、检测和结果判定方法。本标准适用于相关贸易和有害生物监测中地中海实蝇卵、幼虫、蛹的鉴定和成

3、虫的鉴定或复核。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。sN/T2039地中海实蝇检疫鉴定方法PCR法3缩略语SN/T2039界定的缩略语适用于本文件。4方法原理选择实蝇科昆虫线粒体DNACOI基因核苷酸片段为分子标记探针,将探针按预先设置的排列固定于特定的固相支持载体(如:醛基化基片)的表面形成微点阵,利用反向固相杂交技术,用Cy3标记脱氧胞苷三磷酸(Cy3一dCTP)

4、荧光标记的样品分子与微点阵上的探针杂交,实现多个分子之间的杂交反应,并通过芯片扫描信号的判读来检测样品中特定基因片段的存在,最后确定是否为地中海实蝇。5仪器和用具PCR扩增仪、芯片点样仪、芯片扫描仪、离心机、水浴锅、涡旋器、冰箱、电子天平、烘箱、磁力搅拌器。醛基化基片、多孔板、芯片盖片、芯片分隔围栏、芯片粘贴工具、湿盒、杂交盒、计时器、磁柱、芯片架、2L烧杯、15mL离心管、量筒、移液器等。6试剂6.1昆虫基因组DNA提取试剂盒。6.2DNA快速纯化/回收试剂盒。6.3去离子水。6.450%二甲基亚砜

5、(DMSO)。6.50.2%十二烷基磺酸钠(SDS)。6.80.2%硼氢化钠。GB/T28065--20116.710XSSPE(20XSSPE:3mol/L氯化钠,200mmol/L磷酸二氢钠,25mmol/LEDTA,pH7.4)。6.80.3×SSC、0.06XSSC(20XSSC:3mol/L氯化钠,300mmol/L柠檬酸钠)。6.910XPCR缓冲液(Mg”,15mmol/L)。6.10dATP,dTTP,dCTP,dGTP(10pmo[/ML)。6.11Cy3一dCTP。6.12Taq酶

6、。6.13引物(10pmo[//LL)。6.14探针(50Mmol/L)。6.15阳性质粒。6.16乙醇(70%和99.9%)。6.17洗液I(0.3XSSC,0.2%SDS)。6.18洗液Ⅱ(0.06×SSC)。7生物芯片检测方法7.1样品前处理按照SN/T2039进行。7.2基因组DNA制备按照sN/T2039进行。7.3生物芯片探针7.3.1检测探针检测探针包括以下类型的探针(见A.1):——实蝇科通用探针;——地中海实蝇与纳塔尔实蝇近缘种特异探针;——地中海实蝇和非洲芒果实蝇近缘种特异探针;—

7、—地中海实蝇种特异探针;——纳塔尔实蝇C.rosa种特异探针;——非洲芒果实蝇C.Cosyra种特异探针。注1:检测探针是一条20nt~29nt的寡核苷酸;序列为实蝇科昆虫的特异性序列,5’端氨基修饰。注2:实蝇科通用探针能够特异检铡实蝇科昆虫,近缘种探针能够特异检测相应的两个近缘种,地中海实蝇、纳塔尔实蝇和非洲芒果实蝇种特异性探针分别可特异检测上述三种实蝇。7.3.2质控探针质控探针包括以下四种类型探针(见A.2)——定位点探针;——阳性对照探针;——阴性对照探针;——空白对照。7.4芯片制备7.4

8、.1芯片基片:选择光学级醛基基片。2GB/T28065--20117.4.2探针稀释:探针用50%DMSO溶解至终浓度为50/-mol/L,按照探针点阵排布顺序,将探针溶液用移液器加入多孔板中。7.4.3点样:用芯片点样仪将探针点至基片上。实蝇芯片探针阵列排布图参见B.1。一张基片四个探针点阵的示意图参见B.2。注:每个阵列共5行10列,第l行和第1列为定位点探针,其他探针各设三个重复。每张基片可以根据实际需求点1个或多个相同探针点阵。7.4.4水合湾£

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