行业标准:GBT 28063-2011 菜豆荚斑驳病毒检疫鉴定方法.pdf

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1、ICS65.020.01B16园亘中华人民共和国国家标准GB/T28063--2011菜豆荚斑驳病毒检疫鉴定方法Detectionandidentificationofbeanpodmottlevirus201I-12-30发布2012-06-01实施宰瞀鳃紫瓣警糌瞥翼发布中国国家标准化管理委员会况111前言GB/T28063--2011本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TCZ71)提出并归口。本标准起草单位:中华人民共和国厦门出入境检

2、验检疫局、中华人民共和国福建出入境检验检疫局、中华人民共和国深圳出入境检验检疫局。本标准主要起草人:廖富荣、沈建国、郑耘、陈青、林石明、陈红运、黄蓬英、吴嫒。1范围菜豆荚斑驳病毒检疫鉴定方法GB/T28063--2011本标准规定了菜豆荚斑驳病毒血清学和分子生物学的检测鉴定方法。本标准适用于可能携带该病毒的豆科作物的种子、苗木等植物繁殖材料的检测鉴定,也适用于传播该病毒介体昆虫的检测鉴定。2菜豆荚斑驳病毒基本信息中文名:菜豆荚斑驳病毒。英文名:beanpodmottlevirus。异名:beanp

3、odmottlecomovirus(菜豆荚斑驳病毒),podmottlevirus(荚斑驳病毒),desmodiumvirus(金钱草病毒)。英文缩写:BPMV。属豇豆花叶病毒科Comoviridae、豇豆花叶病毒属Comovirus。菜豆夹斑驳病毒的其他信息参见附录A。3方法原理利用基于抗原抗体反应的双抗夹心酶联免疫吸附测定(DAS_ELIsA)、反转录和体外DNA扩增技术的反转录聚合酶链式反应(RT—PCR)进行检测鉴定。4主要仪器设备本标准的检测鉴定方法主要使用以下仪器设备:微量榨汁机、酶标

4、仪、洗板机、微量天平(感量:0.001g)、PCR仪、荧光PCR仪、电泳仪、水平电泳槽、凝胶成像仪、高速冷冻台式离心机、水浴槽、pH计和各种量程的可调移液器(1000pL、200pL、100pL、20pL、2PL)。5检测样品的制备5.1DAS—ELISA和IC-RT-PCR检测样品的制备对每批送检样品进行症状检查,优先选取具有褐色或黑色斑驳症状的种子(从种脐开始),或者选取具有斑驳、皱缩、褪绿等症状的叶片。种子样品:称取0.5g~1.0g的种皮作为检测样品,在液氮中充分研磨,回温后按1:10比例

5、加人样品提取缓冲液继续研磨。叶片样品:称取0.5g~1_0g的叶片作为检测样品,在研钵中研磨或在液氮中研磨,按1:10比例加人样品提取缓冲液继续研磨。把研磨后的样品转移到5mL离心管中,8000r/min离心5min,上清液作为DAS-ELISA(见附录B)和IC-RT-PGR(见附录C)检测提取液。注:提取液在3h内使用,否则保存在4℃中。GB/T28063--20”5.2RT-PCR检测样品的制备称取表现症状的0.1g叶片、种子等样品在液氮中充分研磨后,利用TRIzol方法提取RNA。(见附录

6、D中的D.3)6检测与鉴定6.1检测鉴定流程通常,初筛时采用DAS-ELISA检测方法。当DAS-ELISA产生阳性结果时,再采用IC-RT-PCR或RT-PCR等方法进行验证。当首先采用IC-RT—PCR或RT—PCR方法检测时,如果产生阳性结果,则通过实时荧光RT-PCR方法或序列测定等方法验证。6.2DAS-ELISA检测把制备的样品上清液加入已包被BPMV抗体的在96微孔板中,进行DAS-ELISA检测,每个样品平行加到两个孔中。用健康的植物组织作阴性对照,用感染BPMV的植物组织作阳性对

7、照,用样品提取缓冲液作空白对照,其中阴性对照种类和材料(如:种子或叶片)应该尽量与所检测样品相一致。具体操作过程见附录B。6.3RT-PCR检测分别提取样品和对照的总RNA,反转录合成cDNA后,进行PCR扩增。用健康的植物组织作阴性对照,用感染BPMV的植物组织作阳性对照,用超纯水作空白对照。具体操作过程见附录D。6.4IC-RT-PCR检测把制备的样品上清液加入已包被BPMV抗体的离心管中,然后进行RT-PCR扩增。用健康的植物组织作阴性对照,用感染BPMV的植物组织作阳性对照,用超纯水作空白

8、对照。具体操作过程见附录C。6.5序列测定将PCR产物回收后,进行克隆、测序,或者直接测序,测序可由生物公司完成。把测序所得到的核苷酸序列翻译成氨基酸后与已知的BPMV相应序列进行比对,如果与已知的BPMV相应序列同源性大于75%则判定为BPMV序列,同源性小于75%则判定为非BPMV序列。注:序列比对可利用NCBI网站上的BLAST软件进行,网址为http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/7结果判定与报告7.1结果判定当产生以下检测结果时,则判定为检出B

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