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1、在大肠杆菌内引入甲羟戊酸途径高效合成抗疟药青蒿素前体——紫穗槐-4,11-二烯汇报人：马纳纳2019年11月2日合成生物学：一门生物学与工程学交叉的前沿学科,以生命科学理论为指导,以工程学原理进行遗传设计、基因组改造(重组染色体)和（或）合成以及人造细胞合成。其中,基因组改造(重组染色体)和（或）合成是关键。2019年5月20日,以克雷格·文特尔为首的美国科学家,在Science上公布了人类历史上创造出首个“人造单细胞生物”的消息，以这项成果为代表的合成生物学(syntheticbiology,Synbio)也就受到了前所未有的关注。合成生物学
2、如何创造生命用A、G、C、T为代表的化学物质人工合成DNA(脱氧核糖核酸)片段,由DNA片段合成基因,再由基因组合成生物模块,然后装配成“人造基因组”,最终在实验室里创造出全新生物体。合成生物学与大肠杆菌合成生物学中的底盘生物是合成生物学的“硬件”基础。大肠杆菌(Escherichiacoli)作为最简单的模式生物，由于其背景清晰、生长快速、易于操作，在基础生物研究以及生物技术应用方面有着其他模式生物无可比拟的优越性。大肠杆菌已经成为能源、化合物、材料及药物生产的重要平台，合成生物学的发展促进了大肠杆菌代谢途径的重建，通过精确设计基因环路、重构
3、代谢途径为大肠杆菌提供了新的代谢和生理功能，使其能够高产天然甚至非天然产物。在过去的十年里，基于大肠杆菌的系统生物学得到了迅猛发展。大肠杆菌与青蒿素的合成青蒿素(artemisinin)是中国科学家于20世纪70年代从传统中草药青蒿或称黄花蒿(ArtemisiaannuaL.)中分离提纯的抗疟有效单体,其化学本质是含有“过氧桥”结构(1,2,4-三噁烷环)的倍半萜内酯。以青蒿素为母核经人工半合成获得的青蒿素琥珀酸酯(青蒿琥酯)、青蒿素甲醚(蒿甲醚)、青蒿素乙醚(蒿乙醚)和双氢青蒿素等青蒿素类药物,血中溶解性好,生物利用度高,对氯喹抗性疟疾及致命
4、性脑型疟有特效,已成为世界卫生组织(WHO)倡导的“基于青蒿素的联合疗法”(artemisinin-basedcombinationtherapies,ACTs)首选的抗疟新药。青蒿分布地域狭窄,青蒿素含量低(0.01%~0.5%).化学合成青蒿素产率不理想,成本高.随着全球疟疾发病率(3.8亿人/年)和死亡率(4600万人/年)逐年升高,青蒿素类抗疟药需求量迅猛增长,导致青蒿素原料药供不应求,市场价格飙升.近10年来,为了从根本上解决青蒿素的供需矛盾,国内外争相开展了青蒿素合成生物学及代谢工程研究,一方面尝试在微生物体内重建青蒿素生物合成途径
5、,另一方面对青蒿中原有的青蒿素生物合成途径进行遗传改良大肠杆菌与青蒿素前体大肠杆菌内存在以脱氧木酮糖磷酸(Deoxyxylulose-5-phosphate，DXP)途径为基础的类异戊二烯代谢途径，能合成少量的辅酶Q等。故大肠杆菌非常适合作为生物合成类异戊二烯化合物的宿主菌。本研究在大肠杆菌中引入人工合成的紫穗槐-4,11-合酶基因并构建原核的粪肠球菌Enterococcusfaecalis来源的MVA途径，获得了抗疟药青蒿素前体——紫穗槐-4,11-二烯的高表达。这种微生物半合成青蒿素的方法——先通过改造微生物合成途径获得青蒿素的前体紫穗槐-
6、4,11-二烯或青蒿酸等，再采用相对简单的化学催化步骤可将这些前体转化成青蒿素，可以大规模制备青蒿素，解决资源短缺问题。基本思路：首先在大肠杆菌EscherichiacoliDHGT7中引入人工合成的紫穗槐-4,11-二烯合酶基因，利用大肠杆菌内源的法尼基焦磷酸，成功获得了紫穗槐-4,11-二烯。为提高前体供给，引入粪肠球菌的甲羟戊酸途径，紫穗槐-4,11-二烯的产量提高了13.3倍，达到151mg/L。进一步研究发现了3个限制酶，分别是紫穗槐-4,11-二烯合酶、HMG-COA还原酶和甲羟戊酸激酶；通过调节这些酶的水平，紫穗槐-4,11-二烯
7、产量提高了7.2倍，在摇瓶中达到235mg/L。1.载体构建、目的基因表达采用常用分子克隆技术，如PCR扩增、酶切、连接和转化等构建质粒表达载体。将表达载体转化宿主菌E.coliDHGT7，接入含相应抗生素(Kn、Cm均为25μg/mL)的液体LB培养基中，37℃培养至OD600=0.3~0.4，加入0.2％L-阿拉伯糖诱导，继续培养4~5h。取菌体全蛋白作SDS-PAGE分析,以pET28a为对照。结果在约56kDa处有可见的紫穗槐-4,11-二烯合酶(ADS)的条带。2.摇瓶培养方法挑取新转化的单克隆，接入含相应抗生素的液体LB培养基中，3
8、7℃振荡培养过夜。取过夜培养菌液转接40mL抗性FM2G培养基，使初始菌体浓度为OD600=0.05，37℃、220r/min振荡培养至OD600为0
