实验三酚蛋白含量1 课件.ppt

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1、实验三酪蛋白含量测定——Folin-酚试剂法(Lowry法)一目的要求学习Folin-酚试剂法测定蛋白质含量的原理和方法。进一步掌握分光光度法。二实验原理（一）蛋白质定量检测方法凯氏定氮法（Kjeldahldetermination）双缩脲法（Biuretmethod）Folin－酚试剂法（Folin-phenolReagentMethod）紫外吸收法（UVspectrophotometry）考马斯亮蓝法（Coomassiebrilliantbluestaining）BCA法（Bicinchoninine　acid　assay）1凯氏定氮法（Kjeld

2、ahldetermination）样品与浓硫酸共热，含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸铵。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例，其反应式如下：NH2CH2COOH+3H2SO4——2CO2+3SO2+4H2O+NH3(1)2NH3+H2SO4——(NH4)2SO4(2)(NH4)2SO4+2NaOH——2H2O+Na2SO4+2NH3(3)反应（1）、(2)在凯氏瓶内完成，反应（3）在凯氏蒸馏装置中进行。收集氨可用硼酸溶液，滴定则用强酸。计算所得结果为样品总氮

3、量。如欲进一步求得样品中蛋白质的含量，即用样品中蛋白氮乘以6.25。2双缩脲法（Biuretmethod）双缩脲（NH3CONHCONH3）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。干扰这一测定的物质主要有硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生

4、颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此此法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。3考马斯亮兰法（Bradford法）考马斯亮兰G-250在酸性溶液中主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合，使染料的最大吸收峰的位置由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色，在595nm下测定的吸光度值与蛋白质浓度成正比。本方法目前灵敏度较高,应用广泛。4紫外吸收法（UVspectrophotometry）蛋白质分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质具有吸收紫外光的性质。吸

5、收高峰在280nm处，其吸光度（即光密度值）与蛋白质含量成正比。此外，蛋白质溶液在238nm的光吸收值与肽键含量成正比。利用一定波长下，蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系，可以进行蛋白质含量的测定。5BCA比色法（Bicinchoninineacidassay）在碱性溶液中，蛋白质将Cu2+还原为Cu+再与BCA试剂（4，4´-二羧酸-2，2´-二喹啉钠）生成紫色复合物，于562nm由最大吸收，其强度和蛋白质浓度成正比。此法是一种较新的、高敏感度的蛋白测试法,其优点是单一试剂、终产物稳定，几乎无干扰物质的影响，灵敏度更高（微量检测可达到0.5μ

6、g/ml），应用更加灵活。（二）Folin—酚试剂法1原理两种显色反应产生深蓝色的原因是：在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物，使蛋白质的空间结构被破坏，肽链转变为无规则松散状态，暴露大量的酪氨酸和苯丙氨酸残基，增强了试剂乙反应的灵敏度。Folin—酚试剂乙中的磷钼酸盐—磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸残基还原，产生深蓝色（钼蓝和钨蓝的混合物）。在一定浓度范围内，蓝色深度与蛋白的浓度成正比。2本法的优缺点优点是灵敏度高，比双缩脲法灵敏得多。缺点是费时间较长，要精确控制操作时间，标准曲线也不是严格的直线形式，且专一性较差，干扰物质较多。对双缩脲反应发

7、生干扰的离子，同样容易干扰Lowry反应。而且对后者的影响还要大得多。酚类、柠檬酸、硫酸铵、Tris缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油等均有干扰作用。此法也适用于酪氨酸和色氨酸的定量测定。(三)分光光度计1原理单色光辐射穿过被测物质溶液时，被该物质吸收的量与该物质的浓度和液层的厚度（光路长度）成正比，其关系如下式：A=-log(I/I。)=-lgT=kLc式中:A为吸收度；I。为入射的单色光强度；I为透射的单色光强度；T为物质的透射比；k为吸收系数；L为被分析物质的光程；c为物质的浓度2使用方法1.打开仪器开关，预热20分钟。2.用“波长没置”旋钮调整测试波长

8、。3.打开样品盖，将遮光体置入样品架中的第一格。4.取一支比色杯，加入作为空白对照的溶液，将上