chapter 3 外植体选择和灭菌.ppt

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1、第三章外植体选择和灭菌一般来说，无论何种类型的细胞工程技术，起始阶段均涉及外植体取材、灭菌、接种与培养等基本过程。§1、外植体的选择和灭菌一外植体的选择(一)外植体的基因型不同种类的植物同一植物的不同器官对诱导条件反应是不一致的，有的部位诱导分化的成功率高，有的部位却很难脱分化，或者再分化频率很低单子叶植物不易诱导器官发生。b.木本植物较难诱导。c.存在基因型差异（如番茄29%~63%）d.开始生长季节取材容易诱导。外植体种类及基因型(二)外植体的部位常用的外植体种类：①茎尖（园艺植物组织培养中应用最多，繁殖率高，不易发生遗传变异，但取材有限）②茎段（采用嫩茎的

2、切段促进腋芽萌发，取材容易）③叶（幼嫩叶片组织通过愈伤组织或不定芽分化产生植株，取材容易，操作方便，但易发生变异）；④花球和花蕾⑤种子、根、块根、块茎、花瓣、胚等。对于大多数植物来讲，茎尖是最好的部位，由于其形态已基本建成，生长速度快，遗传性稳定，也是获得无病毒苗的重要途径，但茎尖往往受到材料来源的限制，而采用茎段可解决培养材料不足的困难。在选择植物外植体进行组织培养时，还要求考虑待培养材料的来源是否有保证，是否容易成苗；同时要考虑到该外植体，特别是经过脱分化产生的愈伤组织，是否会引起不良变异，丧失原品种的优良性状。选取适宜的外植体；常用外植体有茎尖、茎段、节间

3、、叶片、叶柄等。C、流水冲洗外植体；D、外植体切割、分离及灭菌处理；E、外植体接种于诱导培养基。F、环境条件控制促进外植体的生长。(三)取材季节取材的季节以早春为好不同植物的取材季节要求各有不同。对大多数植物而言，应在其生长开始的季节采样。在生长末期或已进入休眠期时取样，则外植体可能对诱导反应迟钝或无反应，较难成活。在母株生长旺盛的季节取材，不仅成活率高，而且增殖率也大。(四)器官的生理状态和发育年龄1幼年组织具有较高的形态发生能力作为外植体的器官，其生理状态和发育年龄直接影响形态发生。一般情况下，幼年组织比老年组织具有较高的形态发生能力，生理年龄越老的组织或器

4、官，越接近发育上的成熟，其再生能力逐渐减弱甚至完全失去再生能力。外植体状态：2外植体的来源-生长在自然环境下的植物-有目的地培育在温室控制条件下生长的植物-无菌环境下已经过离体培养的植物自然环境中生长的植株，一般带有微生物，甚至与某些微生物具有寄生关系，使植株具有内生菌。取自这些植物的外植体，在培养过程中会有微生物滋生，从而影响培养效果。自然环境生长植株温室控制条件下生长植株已离体培养植株多数情况下，应尽量使用温室或人工气候室控制培养的植物材料作为外植体来源，减少培养过程中的微生物感染概率。同时，生长在控制条件下的植物可以保持培养料间的一致性，提高实验的可重复性

5、，也便于培养技术的规范。某些多年生植物或特殊材料，必须取自自然生长的植物，就需要尽可能避免使用那些生长过于潮湿和不洁净环境中的植物。对于培养过程中可能出现内生菌污染的材料，应尽量取生长旺盛期的生长点部位作为起始培养的材料。3、供体植株的管理取自室外的外植体材料，供体植株的管理十分重要，这与外植体培养时的污染率密切相关。植株管理中应注意：⑴避免昆虫危害许多昆虫如蚜虫、螨类和飞虱是许多植物病虫害的传播媒介，会引起植物组织的潜在感染。⑵注意防病尤其是真菌和细菌病害的侵染，取自感病植株的外植体，在培养中的污染率远远高于来自健康植株的外植体，必要时需使用化学药剂防治病害。

6、⑶控制湿度给供体植株浇水时应从根部给水，避免从上部浇水，以免上部形成易于病原侵染的湿度环境；尽可能降低温室湿度；取材前尽可能保持植株干爽。3、材料取材⑴材料选择培养材料应选择有代表性的主要植物、选择性状优良的种质或特殊的基因型。快速繁殖时应在植株生长的最适时期取材，花药培养应在花粉发育到单核期取材。(五)外植体大小外植体大小：外植体越小成苗能力越弱，较大的外植体增殖较快。外植体极性：当外植体以形态学的基部接种于培养基上时，从远离基部的表面诱导出芽、苗数目较多。选取材料的大小一般在0.5-1.0cm之间。胚胎培养或脱毒在0.5cm以下。材料太大易污染，材料太小难于

7、成活。外植体取材方法--确定大小取大小适中的茎段、芽体进行清洗、灭菌，大了容易污染，小了不易成活。外植体的大小0.5-1cm，过大的外植体容易污染，过小存活率很低。外植体的大小外植体的来源生理学上的年龄取材的季节选材外植体的选择有什么要求?二、外植体的灭菌灭菌：是指用物理或化学方法将所有致病和非致病的微生物全部杀灭。常用灭菌方法:干热灭菌:150度，40’1２0度，120’湿热灭菌:高压灭菌锅，压力达0.5kg/cm2时放气，压力达1.1kg/cm2,121度,16-30’射线灭菌:紫外灯过滤灭菌:细菌过滤器（孔径0.45um）熏蒸灭菌:每立方米体积2-8mL甲

8、醛＋甲醛一半量的高锰酸钾