核酸分子杂交技术课件.pptx

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1、核酸分子杂交技术高俊燕博奥生物集团有限公司生物芯片北京国家工程研究中心北京博奥晶典生物技术有限公司Contents目录核酸分子杂交的基本理论核酸探针及其标记核酸探针的标记方法核酸分子杂交方法DNA芯片技术2目录核酸分子杂交的基本理论part1Contents34核酸分子杂交的基本理论核酸分子杂交具有互补序列的两条单链核酸(DNA或RNA)分子在适宜的温度及离子强度等条件下,可按碱基互补配对原则退火形成双链杂合体的过程称为核酸分子杂交。核酸分子杂交技术是目前生物化学和分子生物学研究中应用最广泛的技术之一，也是临床分子检验的

2、重要技术。核酸分子杂交技术是20世纪70年代发展起来的一种崭新的分子生物学技术。它是基于DNA分子碱基互补配对原理，用特异性的核酸探针与待测样品的DNA/RNA形成杂交分子的过程。分子杂交实验依据其形式的不同可以分为液相杂交和固相杂交，各类型杂交的基本原理和步骤是基本相同的，只是选用的杂交原材料、点样方法有所不同。5核酸分子杂交的基本理论关键步骤：变性—杂交（复性）—检测信号—结论变性复性DNA-DNA杂交双链分子信号的采集与处理结论核酸分子杂交的基本理论DNA变性1、定义：在某些理化因素作用下，两条DNA链间的氢键断裂

3、，变为单链的过程称DNA变性。2、变性的方法：1）热变性：温度升高到90~100℃时，双链核酸分子链间的氢键完全断裂。2）酸碱变性：pH值低于3或高于10时，双链核酸分子链间的氢键断裂。3）化学试剂变性：如尿素、甲酰胺、甲醛等使双链核酸分子链间的氢键断裂6核酸分子杂交的基本理论3、影响变性的因素1）碱基组成：DNA分子中G＋C含量越高Tm越高。2）溶液的离子强度：DNA链骨架上的磷酸基团带有较多的负电荷，它们之间的静电相斥作用是其双链的不稳定因素之一。在无盐的水中，DNA在室温下就会变性，加入盐后，正离子可以封闭磷酸基团

4、的负电荷，使DNA稳定性增加，Tm值升高。3）pH值：pH值在5～9范围内，Tm值变化不明显。在高pH值下，可使碱基失去形成氢键的能力。当pH大于11.3时所有氢键均被破坏，DNA完全变性。4）变性剂：可以干扰碱基堆积力和氢键的形成，因此可以降低Tm值。常用的变性剂是甲酰胺和脲，通常用50％的甲酰胺以使Tm值降低30℃。7核酸分子杂交的基本理论4、核酸溶液变性后的理化性质变化：粘度降低密度增加紫外吸收值增加(利用DNA变性后波长260nm处紫外吸收的变化追踪变性过程）8核酸分子杂交的基本理论DNA复性1、定义：变性的单链

5、核酸分子在一定条件下按碱基互补原则重新结合为双链核酸的过程，称复性或杂交。具有互补序列的两条单链核酸都可互补形成双链：DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA、寡核苷酸/DNA和寡核苷酸/RNA。2、复性过程1）单链分子间碰撞形成局部双链2）局部双链周围的碱基如不配对时，双链重新解离局部双链周围的碱基如配对，则形成中心序列3）形成完整的双链分子9核酸分子杂交的基本理论3、影响复性的因素1）DNA浓度DNA浓度越大复性速度越快单链探针，浓度增加，杂交效率增加双链探针，浓度控制在0.1-0.5μg，浓度过高影响杂交效率

6、2）DNA的分子质量大分子质量的DNA扩散速度慢，复性速度慢10核酸分子杂交的基本理论3）温度温度过高，有利于DNA变性而不利于复性DNA/DNA杂交，适宜温度较Tm值低20-25℃RNA/DNA或RNA/RNA杂交，加甲酰胺降低Tm值（原位杂交时，杂交液中加入适量的甲酰胺，可避免因杂交温度过高而引起的组织形态结构的破坏以及标本的脱落）用寡核苷酸探针杂交，适宜温度较Tm值低5℃11核酸分子杂交的基本理论4）离子强度通常盐浓度较高时，复性速度较快。5）甲酰胺甲酰胺能降低核酸杂交的Tm值，能降低杂交液的温度，低温时探针与待测

7、核酸杂交更稳定当待测核酸与探针同源性不高时，加50%甲酰胺溶液在35~42℃杂交；如待测核酸序列与探针同源性高时，则用水溶液在68℃杂交12核酸分子杂交的基本理论6）核酸分子的复杂性同样条件下，DNA序列简单的分子复性快，序列较复杂的DNA分子复性则较慢。7）非特异性杂交反应：杂交前封闭非特异性杂交位点，减少其对探针的非特异性吸附常用的封闭物有两类：即非特异性DNA和高分子化合物。如鲑精DNA或小牛胸腺DNA，Denharts溶液或脱脂奶粉13目录核酸探针及其标记Part2Contents14核酸探针及其标记探针的概念核

8、酸探针(probe)是指用放射性核素或其它标记物标记的已知序列的核酸片段。长度一般以50~300bp为宜。制备方法：(1)DNA重组技术(2)PCR扩增(3)化学合成15核酸探针及其标记核酸探针的种类1）基因组DNA探针：有细菌、病毒、原虫、真菌、动物和人类细胞DNA探针，多为某一基因的全部或部分序列，或某一非编码序