实验二 植物总RNA的提取.ppt

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1、实验二、植物总RNA的提取一、实验目的：1.了解真核生物基因组RNA提取的一般原理。2.掌握Trizol提取RNA的方法和步骤。3.了解RNA纯度的检测。二、一般原理Trizol试剂是由苯酚和硫氰酸胍配制而成的单相的快速抽提总RNA的试剂，在匀浆和裂解过程中，能在破碎细胞、降解蛋白质和其它成分,使蛋白质与核酸分离,失活RNA酶,同时能保持RNA的完整性。在氯仿抽提、离心分离后，RNA处于水相中，将水相转管后用异丙醇沉淀RNA。Trizol试剂配制苯酚饱和液（38%）-380ml/L硫氰酸胍盐（0.8M-118

2、.16g）硫氰酸铵（0.4M）--76.12g醋酸钠pH5（0.1M）-33.4ml甘油–50ml加水至1L。三、材料植物组织四、设备移液器，冷冻高速离心机，低温冰箱，台式高速离心机，液氮罐，陶瓷研钵，1.5ml离心管。五、试剂1、无RNA酶的无菌水：用将高温烘烤的玻璃瓶（180℃2小时）装蒸馏水，然后加入0.01%的DEPC（体积/体积），处理过夜后高压灭菌。2、75%乙醇：用DEPC处理水配制75%乙醇，（用高温灭菌器皿配制），然后装入高温烘烤的玻璃瓶中，存放于低温冰箱。3、氯仿:异戊醇[24:1（v/v

3、)]、氯仿。4、异丙醇、无水乙醇、70％乙醇。5、Trizol试剂。六、操作步骤1、取植物嫩叶，液氮研磨，每1.5mltube分装0.1克样品；２.　每管加入0.5mlTrizol液，迅速混匀，注意样品总体积不能超过所用Trizol体积的10%。３、室温下静置5分钟以利于核酸蛋白质复合体的解离４、加入0.5ml的氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15秒，室温静置3分钟５、10000r/min离心5分钟６、取上清液（水相）转入一新的离心管，加入等体积异丙醇，室温放置3分钟，10000r/min离心5分钟。

4、７、弃去上清液，加入至少1ml的70%乙醇，涡旋混匀，4℃下10000r/min离心5分钟。８、小心弃去上清液，然后室温或真空干燥5-10分钟，注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度。然后将RNA溶于20微升TE或DEPC处理过的水中，必要时可55℃-60℃水溶10分钟。RNA可进行mRNA分离，或贮存于70%乙醇并保存于-70℃七、检测1、DNA的紫外分光光度计检测OD260/OD280>1.81OD260=40μg/mLDNA2、甲醛变性琼脂糖电泳检测八、注意事项（1）Trizol、DEPC等有毒，与

5、皮肤接触会引起伤害。操作过程带手套，在通风条件下操作。（2）避免带入RNase进入样品带手套，别用手碰任何与样品接触的物品。使用新的已灭活RNase的塑料器皿与用具。（3）爱护仪器设备,安全操作作业：1、RNA酶的变性或失活剂有那些？其中在总RNA的抽提中主要可用哪几种？2、怎样从总RNA中进行mRNA的分离和纯化。补充：ＤＮＡ检测方法１.此外分光光度计检测ＯＤ２６０值＝１时，相当于含５０μg/mLDNAＯＤ２６０／ＯＤ２８０＝１.８～１.９时，DNA较纯小于１.８时，蛋白含量较高，大于２.０则含有ＲＮＡ或有

6、断裂ＤＮＡ１.琼脂糖电泳检测