蛋白质冻融过程中的物理化学变化.ppt

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时间:2020-08-09

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1、蛋白质冻融冻融过程到底发生了什么?低温生物学化学热动力学晶体学冻融胁迫的产生冻融保护蛋白质冻融冰晶浓度差异在静置情况下融化,往往会看到溶液分层情况肉眼能观察到的冻融现象不均匀的体系变化融解工艺上有不同升温速率Slowwarming1-5℃/min:室温或自来水摇intermediatewarming>5℃/min:37℃或以上的水浴目前常用的冻融工艺步骤冷却cooling冷冻freezing等温保持温度意义设备生物样品存储应用0~-600C为组织和细胞内水的结晶温度,温度进入此范围组织内的水开始结晶

2、伤害细胞和组织微观结构。各种冷冻冰箱可中长期保持经过提纯的生物大分子的稳定性,但不能存保持组织中的生物大分子稳定性、细胞活性及组织微观结构。-800C为水的结晶温度之下较为安全的温度,同时样本内的生化反应显著减弱。也是目前自动化存储设备所能使用的最低温度。超低温冰箱可中期保持组织内生物大分子的稳定性;短期保持细胞活性和组织微观结构。-1360C为水的玻璃化温度,水的结晶对细胞和组织不再有明显伤害,样本内的各种生化反应几近停止。液氮箱/罐气相; 深冷冰箱可中长期保持组织内生物大分子、细胞和组织微观结构

3、的稳定性,为不少样本库推荐用于长期冻存组织。-1960C为液氮蒸发的温度,是常规方法所能实现的最低温度。样本内的各种生化反应可以认为停止,水的结晶对细胞和微观组织的伤害可以忽略。液氮箱/罐液相可长期保持组织中的生物大分子稳定性、细胞活性及组织微观结构,但对存储耗材有较高要求。生物样品常用存储温度一、物理胁迫低温变性冷冻浓缩效应冰晶形成二、化学胁迫冷冻胁迫低温变性效应通常发生在0℃下,诱导蛋白质解折叠蛋白质的吉布斯自由能随温度变化趋势认为跟温度下疏水残基的溶解度增加变性温度与pH、蛋白浓度、添加剂(如

4、糖、离液剂等)有关低盐低温β-lactoglobulinchymotrypsinogenlactatedehydrogenasemyoglobinphosphoglyceratekinaseribonucleaseandstaphylococcalnuclease冷冻过程中的温度变化溶质浓度与粘度升高溶质重新分布溶质结晶(过饱和)pH变化相分离2.冷冻浓缩效应Figure2.Temperature,%soluteconcentration,andviscosityprofilesasafunctio

5、noftemperatureduringfreezingof3%sucrose.Thedatawerecalculatedbyassumingicecrystallizationoccursat−15°Candthatthesolutioncompositionfollowstheequilibriumfreezingpointdepressioncurve.Theviscositieswereestimatedfromafitofviscositydataoverawiderangeofcompo

6、sitionandtemperaturetoaVogel-Tammann-Fulcher-typeequation.DatatakenfromReference7(1)溶质浓度与粘度升高,溶质重分布引起反应速率发生改变冰-水界面上形成浓度梯度(2)pH变化酸变碱或碱变酸的pH巨大变化都是可能的溶质结晶一般发生在低浓度溶质中,原因可能在于离子在冰与水之中迁移,不同离子迁移性质与速率不同KH2PO4不容易析出Na2HPO4过饱和析出KH2PO4-Na2HPO4-H2O系统中KCl引起pH升高,>6NaC

7、l引起pH降低,<4Ref:ProteinStabilityDuringFreezing,SeparationofStressesandMechanismsofProteinStabilization没食子酸GallicAcid在有NaCl存在时冻融发生分解分解反应发生只在碱性溶液中,酸性环境基本不发生提供一种思路:不添加碱性试剂的前提下,从中性或酸性环境下催化碱性反应。共晶点:-16.7℃即使共晶点以下,溶质扩散还在发生没食子酸在长期保存时浓度发生的变化重组血红蛋白hemoglobin在PEG-D

8、extran系统中的相图混合液7%PEG7%Dextran顶层10%PEG0.2%Dextran底层2%PEG20%Dextran(3)相分离现象诱导蛋白质结构损伤蛋白质分配进两种相中,可能使稳定剂失去保护作用改变稳定所需的分子间相互作用形成两相界面(在不完全分离体系中,蛋白质大面积暴露)可发生于电解质-聚合物聚合物-聚合物聚合物-多糖蛋白质-多糖蛋白质-蛋白质蛋白质-表面活性剂糖-蛋白质-多糖电解质-聚合物-多糖存在相分离现象PEG/PVP-DextranPVP-f

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