吸收光谱法及荧光分析法课件.ppt

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1、吸收光谱法及荧光分析法主讲：易有荣吸收光谱法吸收光谱法是根据物质对不同波长的光具有选择性吸收而建立起来的一种分析方法。它既可对物质进行定性分析也可定量测定物质含量。包括紫外、可见光及红外吸收光谱等。如果在测定时利用单色器获得的单色光来测定物质对光的吸收能力，则称为分光光度法。人眼能产生颜色的光区称可见光区，其波长范围为380-760nm。近紫外光区的波长范围为200-380nm。吸收光谱法紫外-可见光光分光光度法是根据物质分子对200-760nm光区的吸收特性而进行分析的方法，其特点是：1)灵敏度高，能测定生物试样中的微量物质。2）选择性强，由于组分

2、的分子结构不同，它们的吸收光谱不同，因此只要选择适当的分离步骤和实验条件，就可以进行生物试样中的单组分和多组分的测定。3)精密度和准确度较高。4)仪器设备简单，操作易掌握。定性能力较弱，通常还需与红外、色谱、质谱等技术结合才能作出可靠的定性鉴定。物质对光的选择性吸收太阳或白火只灯（钨灯）发出的可见光，是一种由许多不同波长的光所组成的宽广光谱，若将它通过三棱镜分光，则可看到红、橙、黄、绿、青、蓝、紫等颜色。可见，白光是混合光，它是由多种不同波长范围的单色光按一定比例混合而成的。如果把两种适当颜色的光按一定比例混合也可得到白光，则这两种颜色互称为互补色。

3、物质对光具有选择性吸收的能力。同一物质对不同波长光的吸收能力不同，不同物质对同一波长光的吸收能力也不同。物质所呈现的颜色正是由于它对光的选择性吸收而产生的。物质对光的选择性吸收当一束光照射到某一物质的溶液时，若该溶液对可见光谱中各种颜色的光都不吸收则溶液呈透明无色状；若几乎全部吸收则溶液呈黑色；若对各种颜色的光都能均匀吸收一部分则溶液呈灰色。若溶液对其中某些波长的光吸收较多，透过较少；而对另一些波长的光吸收较少，透过较多，则溶液就呈现这种吸收较少透过较多的光的颜色，即溶液的颜色是它所吸收色光的互补色。例如；KMNO4的水溶液选择性吸收可见光中的大部分

4、黄绿色光，故呈紫色；硫酸铜溶液选择性吸收黄光而呈蓝色。物质颜色与吸收光颜色、波长的关系物质颜色吸收光颜色吸收光波长（nm）黄绿紫色400－450黄色蓝色450－480橙色绿色480－490红色蓝绿色490－500紫红色绿色500－560紫色黄绿560－580蓝色黄色580－600蓝绿色橙色600－650蓝绿色红色650－750吸收光谱如果测量某种物质对不同波长光的吸收程度，以波长为横坐标，以吸光度为纵坐标作图，则可得到一条曲线，称为吸收曲线，也称可见－紫外吸收光谱，它能清楚地描述物质对光的吸收情况。由于有机化合物发色团和助色团的种类、数目及其在分子中

5、所处的位置和环境不同，因此测到的吸收光谱不相同。依据物质吸收光谱的形状和特征可作该物质的鉴别、纯度检查和初步结构分析。光吸收的基本定律；朗伯－比尔定律紫外-可见光吸收光谱的最主要用途是定量分析，即通过吸收光谱选择一个或几个测定波长，测定试样中一个或几个组分的含量。紫外-可见光吸收光谱定量分析的基础是朗伯－比尔定律。它说明了吸光物质对单色光吸收的程度与该物质的浓度与厚度之间的关系，是吸收光谱的基本定律。当单色光通过厚度一定、均匀的吸收溶液时，该溶液对光的吸收程度与溶液中物质的浓度C成正比，即A=KBC光吸收的基本定律；朗伯－比尔定律K为吸光系数，B为溶

6、液的厚度，C为吸光物质的浓度K与物质的性质、温度、入射光的波长等有关。上式的物理意义为；当一束平行的单色光通过均匀透明溶液时，该溶液对光的吸收程度与溶液中物质的浓度和光通过液层厚度的乘积成正比。吸收光谱的应用只要被测物质在紫外－可见－近红外波段由吸收光谱，就可用光谱分析法来定性和定量分析。1）定性分析；比较光谱的一致性，与其它方法结合进行分析。2）定量分析；标准曲线法配制与被测组分相同的一系列标准溶液，在与被测组分相同的最大吸收波长下，测定各标准溶液的A值。以A值为纵坐标，以浓度C为横坐标,绘出浓度－吸光度关系曲线，就是标准曲线。将样品溶液在相同条件

7、下测定A值，在纵坐标上找出与A值相对应的浓度即为样品的浓度。标准曲线法理想的标准曲线应该是；不同浓度的标准溶液所测得的吸光度对浓度作图时，是一条斜率接近于1且通过原点的直线。标准溶液的浓度范围应在被测物质浓度的一半到两倍之间。吸光度在0、05－1、0之间。绘制标准曲线至少应由五个点，每个点由两个以上的重复值，曲线不能任意延长。利用标准管计算测定物含量；将标准与样品分别在相同条件下显色，测定其吸光度，因是相同物质在相同条件下测定，故可按下式计算样品的浓度；A样/A标＝KC样L/KC标LA样/A标＝C样/C标此法适和A-C线性关系良好且通过原点的情况。紫

8、外分光光度计的基本结构光源单色器吸收池检测器信号显示系统紫外分光光度计的基本结构—光源必须具有稳定的、有足够