白细胞介素32(IL-32)分子克隆巨噬细胞肿瘤坏死因子α论文.doc

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1、白细胞介素32(IL-32)分子克隆巨噬细胞肿瘤坏死因子α论文【提示】本文仅提供摘要、关键词、篇名、目录等题录内容。为中国学术资源库知识代理,不涉版权。作者如有疑义,请联系版权单位或学校。【摘要】结核病是一种由结核分支杆菌感染而引发的慢性肉芽肿性炎症。该病属人畜共患疾病,病原菌一旦侵染可感染人畜全身多个器官,危害极大。近年来,结核病的发病率在全球范围内一直呈上升趋势,特别是牛结核疫情的加重不仅威胁动物群体健康,更加威胁人类身体健康,因此生产转基因抗结核牛具有重大意义。目前国内转基因动物技术已达到一定水平,但选择合适的用于转基因动物的基因仍不多。本研究克隆的牛白细胞介素32(

2、Interleukin-32,IL-32)基因是近年发现的一种新型功能基因,其主要作用是诱导其他细胞因子和化学因子的产生,并在自身免疫性炎症性疾病中发挥重要作用。目前已经发现IL-32具有抑制结核分支杆菌(Mycobacterium)等多种分支杆菌感染,提高动物机体抗病能力的作用。结核分枝杆菌可以从人类单核细胞和巨噬细胞中通过半胱天冬酶-1/IL-18/Interferon-γ-依赖机制诱导IL-32的产生,在人巨噬细胞中,IL-32的高表达,可显著降低宿主细胞内结核杆菌的存活率。本研究分析了牛IL-32β在秦川牛不同组织中的表达情况,牛IL-32β在秦川体内主要分布于脾脏

3、和肾脏,其他组织目前尚未发现。并从秦川牛脾脏中分子克隆了牛IL-32β基因的可变剪接体牛IL-32γ基因,序列分析表明,牛IL-32γ比牛IL-32β序列多了第二个内含子,从而导致编码序列多编码47个氨基酸。构建牛IL-32γ的原核表达载体,并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达出该蛋白,摸索蛋白表达条件,IPTG浓度为1mg/mL,温度为28℃时,表达效果较好。成功的表达该目的蛋白为制备多克隆抗体打下了一定基础。为制备其单克隆抗体提供参考。为了进一步研究该可变剪接体的功能,本研究构建了真核表达载体pIRES-IL32γ-GFP,将该载体稳定转染至小鼠巨噬细胞RAW264.7

4、,得到超表达牛IL-32γ基因的小鼠巨噬细胞系,同时以稳定转染人IL-32γ基因的小鼠巨噬细胞为阳性对照,Real-timePCR检测表明,超表达IL-32γ的细胞具有调节IL-1β、IL-6、MIP2、TNFα等细胞因子表达的功能,其趋势与阳性对照人IL-32γ的趋势相近。。本研究为进一步研究牛IL-32γ基因生物学功能提供了重要依据。【关键词】牛;白细胞介素;32(IL-32);分子克隆;巨噬细胞;肿瘤坏死因子α;【篇名】牛白细胞介素32基因β、γ亚型的分子克隆与功能验证【目录】牛白细胞介素32基因β、γ亚型的分子克隆与功能验证摘要6-7ABSTRACT7-8文献综述1

5、2-20第一章白细胞介素32基因研究进展12-201.1IL-32的生物学特性12-131.1.1IL-32的来源121.1.2IL-32的亚型12-131.2IL-32的生物学功能13-151.2.1IL-32诱导细胞因子产生炎症反应13-151.2.2IL-32介导T细胞凋亡151.3IL-32的受体及信号转导15-161.4IL-32与疾病发生16-201.4.1IL-32与类风湿关节炎16-171.4.2IL-32与克罗恩病171.4.3IL-32与癌症17-181.4.4IL-32与流感181.4.5IL-32基因与结核菌18-20试验研究20-55第二章牛白细胞

6、介素32基因Β、Γ亚型的序列分析与分子克隆20-352.1试验材料20-222.1.1试验用组织、工程菌及载体202.1.2试验用主要试剂及工具酶202.1.3试验用主要仪器与设备20-212.1.4主要试剂配方212.1.5分子生物学与生物信息学软件、数据库、网站21-222.2试验方法22-272.2.1数据库中牛白细胞介素32基因的序列比对222.2.2牛白细胞介素32基因的分子克隆22-272.2.3牛IL-32β的组织表达特异性分析272.2.4牛IL-32基因生物信息学预测与分析272.3试验结果27-332.3.1牛白细胞介素32基因的序列分析27-292.3

7、.2牛白细胞介素32基因的分子克隆29-302.3.3牛IL-32β的组织特异性表达30-312.3.4牛IL-32基因生物信息学分析31-332.4讨论33-342.5小结34-35第三章牛白细胞介素32基因的原核表达35-413.1试验材料35-363.1.1试验用工程菌及载体353.1.2试验用主要试剂及工具酶353.1.3试验用主要仪器与设备35-363.1.4主要试剂配方363.2试验方法36-383.2.1白细胞介素32基因的原核表达载体的构建36-373.2.2白细胞介素32基因在大肠杆菌BL21(D

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