实时荧光PCR技术检测过敏原小麦的研究.doc

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时间:2020-04-28

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1、实时荧光PCR技术检测过敏原小麦的研究摘要:采用实时荧光PCR技术检测过敏原小麦成分。结果表明,采用小麦管家基因GAG56D和Wx012基因的特异性检测引物和探针进行检测时,26种样品经实时PCR扩增,只有小麦产生阳性的荧光信号,其余样品均不产生荧光信号。灵敏度实验结果表明,该方法对小麦过敏原基因的检测灵敏度较高,可达到1.0mg/kg,符合痕量检测要求。关键词:小麦;实时PCR;过敏原检测中图分类号:Q789文献标识码:A文章编号:0439-811405-1053-03DetectingSensitinogenWheatinFoodbyReal-timePCRDONGWei1,2,CAOJi

2、-juan2,ZHENGQiu-yue2,WUYuan-hua1Abstract:Toidentifysensitinogenwheatinfood,areal-timefluorescentPCRassaywasperformed.Theresultshowedthattheprimersandprobeofwheathouse-keepinggenesGAG56DandWx012couldspecificallyidentifywheatwithin26kindsofsample.Sensitivityresultsshowedthat1.0mg/kgofwheatinfoodcouldb

3、edetected,andmeettheneedoftracedetection.Keywords:wheat;real-timePCR;sensitinogendetection近年来,食物过敏的发生率正继续增加,过敏性疾病发病率在全球呈逐年上升趋势,发达国家超过20%的人受过敏性疾病的困扰[1]。过敏原又称变态反应原,是指能够使人发生过敏的抗原。美国和欧盟从2007年开始执行新的食品过敏原标签法规,法规分别要求生产企业明确标明其产品中是否含有8大类和12种主要的食品过敏原,包括小麦、大豆、花生、芹菜、芥末、芝麻和坚果,畜禽产品,水产品等。根据小麦过敏原以及潜在的过敏免疫机制表明,小麦过敏会

4、影响皮肤、内脏、呼吸道的健康,引起运动激发过敏症、职业哮喘、鼻炎、接触性荨麻疹等[2]。传统的生物活性检测精确度和灵敏度不高,目前采用实时荧光PCR技术实现了PCR从定性到定量的飞跃,具有实时监测、消除交叉污染、特异性强、定量结果准确等特点[3]。本实验采用实时荧光PCR技术,建立了食品中过敏原小麦成分的快速检测方法,为食品过敏原的标签管理、监管、检测提供了可靠的技术支撑。1材料与方法1.1材料实验于2008年8月在辽宁出入境检验检疫局技术中心实验室进行。实验所用小麦、大麦、燕麦、荞麦、黑麦、白芝麻、糙米、绿豆、玉米、黑大豆、雪豆、泰国香米、花豆、黑小豆、黄豆、豌豆、饭豆、黑大米、胡萝卜、大白

5、菜、韭菜、油菜、花生米、高粱、薏米和小米这26份样品由大连农业科学院、沈阳农业大学等多家单位提供,或购于大连家乐福超市。TaqManGExPCRMaster酶预混液购于美国ABI公司。用于DNA提取的主要试剂CTAB缓冲液配制方法为55mmol/LCTAB,1400mmol/LNaCl,20mmol/LEDTA,100mmol/LTris-HCl,用10%盐酸调pH值至8.0,121℃,高压灭菌20min,备用。实验采用的仪器有ABI7300实时荧光PCR仪,核酸蛋白分析仪,台式高速冷冻离心机。1.2方法1.2.1基因组DNA的抽提采用宝生物工程有限公司生产的DNA提取试剂盒并按其操作说明进行

6、抽提样品的DNA。1.2.2DNA浓度和纯度的测定取5μLDNA溶液加ddH2O梯度稀释至1mL,使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计测260nm和280nm处的吸光值。DNA的浓度按照公式C=A×N×50÷1000计算获得,式中C为DNA浓度,A为260nm处的吸光值,N为核酸稀释倍数。OD260=1.0表示双链DNA浓度为50μg/mL。当OD260/OD280比值为1.7~1.9时,适宜于PCR扩增。1.2.3引物和探针设计根据NCBI上已公布的小麦管家基因GAG56D和Wx012基因的核酸序列,在引物的设计上对小麦管家基因检测引物和探针的退火温度的一致性、GC含量的相似性等因素进行了充分

7、的考虑,采用DNAMAN8.0软件设计了小麦管家基因GAG56D和Wx012基因的引物和探针。检测GAG56D基因的引物和探针序列中正向引物为:5′-CAACAATTTTCTCAGCCCCAACA-3′;反向引物为:5′-TTCTTGCATGGGTTCACCTGTT-3′;探针为:5′-FAM-TTCCCGCAGCCCCAACAACCGC-Eclipse-3′。检测Wx012基因的引物和探针序列中

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