超滤离心在双水相萃取大肠杆菌谷氨酸脱羧酶中的应用.pdf

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1、、20现代化工蓖34卷幕4期·74·川e㈣ji；rv2{jl4年月超滤离心在双水相萃取大肠杆菌谷氨酸脱羧酶中的应用李海鑫，孙波，赵晓，樊庆，孙盛，孔庆敏(东北农业大学食品学院，黑龙江哈尔滨150030)摘要：建立聚乙二醇(PEG)／磷酸氢二钾(K2HPO4)双水相体系，通过对大肠杆菌(EscherichiacoliAS1．505)细胞进行超声波破碎制得谷氨酸脱羧酶(glutamatedecarboxylase，GAD)酶液，并利用双水相萃取对GAD进行分离纯化，然后，采用超滤离心对双水相上相中的GAD与PEG进行分离并分别

2、回收。实验结果表明，大部分GAD分配于上相，其纯化倍数为55．60，酶活率为97．78％。通过响应面分析，对超滤离心工艺参数进行优化，确定了超滤离心转速为10000r／min，离心时间为20min，}昆合液的稀释倍数为5倍，此条件下GAD的回收率为81．52％，PEG的回收率为84．41％。关键词：谷氨酸脱羧酶；双水相萃取；超滤；离心；分离；回收中图分类号：TS252．1文献标志码：A文章编号：0253—4320(2014)04—0074—04Applicationofultrafiltrationonaqueoustwo

3、phaseextractionforpurificationofGADfromE．coliLIHai—xin，SUNBe，ZHAOXiao，FANQ，SUNSheng，KONGQ一min(CollegeofFoodSciences，NortheastAgriculturalUniversity，Harbin150030，China)Abstract：Anaqueoustwo—phasesystemcomposedofPEGandK2HPO4isestablishedforthepurificationofglutamate

4、decarboxylase(GAD)fromthecelldisruptionofEscherichiacell(E．coli)．Then，GADandPEGinthetopphasearefullyseparatedbyuhrafihrationwithcentrifugalultrafihrationunits．TheresultsshowthatthesystemiscapabletopartitionmostGADtothetopphaseanda55．60foldpurificationofGADisachiev

5、edwithanaverageof97．78％GADrecovery．Responsesurfacemethodologyisutilizedtooptimizetheprocessparametersofuhrafihration．Theoptimalconditionsareasfollows：10000r／minfor20minutesand5multiplesdilutionofthemixture．TherecoveryofGADandPEGcanreach81．52％and84．41％．respectively

6、．Keywords：glutamatedecarboxylase(GAD)；aqueoustwo—phasesystemextraction；uhrafihration；centrifugation；GAD是生物体内广泛存在的一种酶，可专一地用蛋白质、酶等物质在双水相间分配的差异性从而得催化，J一谷氨酸脱羧生成y一氨基丁酸¨J。y一氨基丁到分离提纯¨卜14]。GAD经双水相萃取后，需进一步酸是中枢神经系统主要的抑制性神经递质，具有多与成相物质PEG分离，在回收产物GAD的同时回收种保健功效J。因此，近年来一氨基丁酸在食品P

7、EG，以减少试剂的消耗，降低成本及减小环境污染。工业中得到广泛的应用，对其需求量也不断增然而，目前GAD与PEG的分离及回收存在着一定的加。为了满足这种需求，获取大量高纯度的技术限制，这也是制约双水相萃取技术在工业化分离GAD成为亟待解决的问题。目前分离GAD的技术纯化蛋白质及酶等领域应用的主要原因之一。有很多，如盐析法m]、有机溶剂法⋯]、层析法超滤离心是根据物质相对分子质量的不同进行等，但这些方法存在提取酶的酶活性较低，有机溶分离的一种手段，其在以蛋白质为主要成分的分离剂残留，专一性不强，操作复杂，成本高等缺点。方面应

8、用较多，而关于蛋白质与高聚物混合物的分利用大肠杆菌细胞获取GAD是一种比较常见的方离报道较少。因此，将超滤离心用于双水相萃取后法，但该方法要获取高纯度的GAD尚存在一定的的GAD与PEG分离与回收中，可以使工业上提取问题。GAD更加便捷。笔者采用PEG／KHPO双水相对双水相萃取技术(Aqueoustw