蛋清中溶菌酶的提取及其体外抑菌试验.pdf

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1、中国畜牧兽医文摘2014年30卷第2期基础科学蛋清中溶菌酶的提取及其体外抑菌试验金喜新‘王海燕(1．河南省动物卫生监督所，河南郑州450008；*2．河南农业职业学院，河南中牟451450)[摘要]本试验从鸡蛋蛋清中提取溶菌酶，测定提取的溶茵酶含量，制备溶菌酶含量标准曲线。通过检测其对金黄色葡萄球菌、猪链球茵、猪伤寒沙门氏菌和产气荚膜杆菌最小抑茵浓度(MIC)、最小杀菌浓度(MBC)、抑菌环大小，来比较其体外抑茵效果。结果：提取的溶菌酶对金黄色葡萄球菌和猪链球菌MIC均为5g／ml、MBC均为20g／m1，对产气荚膜杆菌的M

2、IC、MBC分别为10“g／m1和40g／m1，对猪伤寒沙门氏菌的MIC、MBC分别为20g／ml和80¨g／m1。提取的溶菌酶对金黄色葡萄球菌、猪链球菌、猪伤寒沙门氏菌和产气荚膜杆菌的抑菌环大小分别为30mill、28mil、15mm和26mm。以上结果表明，提取的溶菌酶对金黄色葡萄球菌和猪链球菌抑菌作用最敏感。[关键词]溶菌酶最小抑菌浓度(MIC)最小杀菌浓度(MBC)体外抑菌作用溶茵酶(1ysozyme)，全称为1，4一B—N一溶菌酶，是一种能液稀释，用乙酸调pH值至4．5，75℃水浴10rain后取出，静止1h够水解

3、革兰氏阳性菌细胞壁中粘肽的糖苷键的酶，使细胞壁破后离心取上清，281nm波长吸光度测定其吸光度，用上述标准曲坏，水分进入，最后细菌崩解死亡[1】。因此，它是一种安全、可线回归方程计算制备的溶菌酶含量。靠且性能良好的杀菌剂，已广泛应用于食品防腐、医药制剂、化1．4溶菌酶的抑菌试验工等行业。溶菌酶广泛存在于鸟类、家禽的蛋清中和动物的泪1．4．1培养基的制备f1)肉浸液肉汤：①成分：绞碎牛肉500液、唾液、血浆、乳汁、胎盘以及体液、组织细胞内，其中在蛋g，蛋白胨10g，磷酸氢二钾2g，氯化钠5g，蒸馏水1000ml。清中含量最丰富

4、】。溶菌酶也因其高效、安全、绿色及无抗药性②制法：将绞碎去筋膜无油脂的牛肉500g加蒸馏水1000ml，等特点逐渐在畜牧业生产中引起业内人士的兴趣及高度关注。混合后在冰箱中过夜，除去液面的浮油，水浴煮沸30rain，使1材料与方法肉渣完全凝结成块，用绒布过滤，并挤压搜集全部滤液，加水1．1材料补足原量。加入蛋白胨，氯化钠和磷酸盐，加热溶解后调节pH新鲜鸡蛋数枚，NaCl细粉，0．9％的NaC1浓液，NaOH至7．47．6。煮沸并过滤，分装烧瓶，121℃高压灭菌30rain。(1M)，NaAC(pH4．6)，布氏漏斗等；猪链球

5、菌，金黄色葡萄(2)营养琼脂：①成分：肉水1000ml，蛋白胨10g，磷酸氢二球菌，猪伤寒沙门氏菌，产气荚膜杆菌均由河南农业大学动物微钾1g，氯化钠5g，琼脂20g。②制法：将上述成分混合后，加生物实验室鉴定保存。热溶解，补足水分。校tpn为7．4～7．6，用纱布夹棉花过滤。分1．2溶菌酶的提取Ⅲ装于中试管或三角瓶中。121℃高压灭菌30rain后，将中试管摆1．2．1蛋清除杂取新鲜鸡蛋的蛋清，按其体积的两倍量加入蒸成斜面，保存备用。馏水，轻轻搅拌5rain，使蛋清与水均匀混匀，最后用双层细纱布1．4．2最小抑茵浓度的测定⋯

6、按照试管二倍稀释法进行。即首过滤，除去蛋清溶液中的脐带块及碎蛋壳等杂质。先用PBS将制得的溶菌酶作1：100稀释。取带有硅胶塞的无菌试1．2．2盐析按每100ml蛋清溶液分别加入2g、5g、7gNaC1管10个，每管中加入2ml的营养液。第1管中加入2ml、l：100稀的比例，向蛋清溶液中慢慢加入NaC1细粉，边加边搅拌，使NaC1释的溶菌酶，混匀后，吸取2ml混合液加入第2管中，混匀后，再细粉充分溶解，避免局部盐浓度过高而引起蛋白质的变性，从而吸取2ml混合液加入到第3管中，用同样的方法依次二倍稀释至第产生大量的白色沉淀。

7、10管，弃去2ml；第11管作为生长对照，37℃培养36h，以无细1．2．3粗提用1MNaOH溶液将上述蛋清溶液的pH值调节到菌生长的最低浓度为最小抑菌浓度(MIC)。10．8。在滴~INaOn溶液的过程中应注意缓慢地逐滴滴人并不断搅1．4．3最小杀茵浓度的测定即从上述溶菌酶的MIC和高于MIC拌，避免局部过碱而导致蛋白质变性，从而影响溶菌酶的产出和浓度的各试管中，吸取50l液体培养基，转接种于肉汤琼脂斜面质量。分别在0℃、4℃、10℃低温下静置，溶菌酶晶体将慢慢培养基上，37℃培养36h，然后观察有无菌落形成，若无菌落形析

8、出，于4d后收集晶体。待结晶完后，倾去上清并用布氏漏斗滤成的相应试管中的溶菌酶浓度，即为该溶菌酶对该菌株的最小杀出结晶，即得粗制的溶菌酶晶体。菌浓度(NBC)。1．2．4精制溶菌酶将上述制得的粗结晶用pH4．6醋酸溶解，让1．4．4抑菌环测定试验采用琼脂平板内挖洞法稍加改良溶液静止2h，过