鸡传染性贫血病毒病LAMP快速可视化检测方法的建立.pdf

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1、第32卷第6期家畜生态学报Vo1.32NO.62011年11月ActaEcologiaeAnimalisDomasticiNOV.2011鸡传染性贫血病毒病LAMP快速可视化检测方法的建立邓显文,谢芝勋,谢志勤,刘加波,庞耀珊,谢丽基,彭宜,范晴(广西兽医研究所,广西畜禽疫苗新技术重点实验室,广西南宁530001)[摘要]为建立一种能快速检测鸡传染性贫血病毒病(CIAV)的检测方法,根据基因库中鸡传染性贫血病毒病的保守序列,设计一套特异性环介导等温扩增(LAMP)引物,建立了CI—Av的LAMP可视化检测方法。该法敏感性可迭10fg,高于常规PCR方法10倍;全部反应可在lh内完成;可通过

2、肉眼观察颜色直接判定结果;对其它鸡常见病原体的检测结果均为阴性。结果表明建立的LAMP方法简便、快速、灵敏、特异,可用于CIAV感染的快速检测。[关键词]鸡传染性贫血病毒病;LAMP;检测[中图分类号]$811.6[文献标识码]A[文章编号]1005—5228(2011)06—0057—04鸡传染性贫血(chickeninfectiousanemia,鸡传染性贫血病毒病,为临床检测鸡传染性贫血病CIA)是由鸡传染性贫血病毒(CIAV)引起的以侵害毒的感染调查奠定基础。目前,国内外均未见有用雏鸡为主的一种免疫抑制性传染病,CIAV可引起3Calcein+MnCl2替代了SYBRGreen和G

3、eneFind—周龄以内鸡严重贫血、出血,骨髓和淋巴器官严重萎er建立的CIAVLAMP可视化检测方法的相关报缩口]。临床上CIAV感染鸡群常伴发或继发其它疾道,现将研究进展报告如下。病,甚至引起疫苗免疫失败等。近几年的流行病学1材料与方法调查表明,CAIV在我国鸡群中的感染非常普遍,感染率高达4O~96l_2]。1.1病毒株目前CAIV检测的主要方法有:PCR法[3-s]、地本研究所使用的鸡传染性贫血病毒Cux一1标准高辛或生物素标记CAIVDNA探针法、间接免疫过株、鸡毒支原体(MG—S6)由美国康州大学Khan教氧化物酶分析法(1iP)、间接酶联免疫吸附试验(in—授惠赠,2株CIA

4、V分离野毒株“]、传染性支气管炎directELISA)、阻断式酶联免疫吸附试验(blocking病毒(H120)、喉气管炎病毒(ILTV)、鸡新城疫ELISA)、原位杂交(IsH)、间接免疫荧光试验(IIF)病毒(NDV—Lasota)、禽流感病毒(H9)、马立克等],但是需要使用昂贵的仪器和试剂等。环介导(MD)、大肠杆菌(O57)、禽巴氏杆菌(C48—1)、鸡白等温扩增技术(1oop—mediatedisothermalamplifi—痢由本研究室保存。cation,LAMP)是由Notomi等[8建立的一种新型1.2引物设计核酸扩增技术,该技术具有简捷、成本低廉和结果可参照Genb

5、ank中CIAV的VP2基因序列,利视化等优点,目前在一些病原微生物的检测中被广用PrimerExporerV4在线设计软件,设计LAMP泛运用_9。本试验用Calcein+MnCl。替代了引物,其中包括2条外引物F3/B3和2条内引物sYBRGreen和GeneFinder构建LAMP方法检测FIP/BIP,以及2条用于提高扩增效率的环引物[收稿El期]2O11-11一o7[基金项目]广西科技攻关项目(桂科攻0537008—3A;桂科攻1123007—4);广西特聘专家专项经费(2011B020);新世纪百千万人才工程国家级人选专项经费(945200603)[作者简介]邓显文(1963)

6、,男,广西贺州人,大学本科,研究员,主要从事禽病及动物分子生物学研究工作。E—mail:xianwendeng@yahoo.corn.cn*[通讯作者]谢芝勋(1963一),男,广西博白人,研究员,主要从事禽病及动物分子生物学研究工作。E—mail:xiezhixun@126.corn58家畜生态学报第32卷Bloop和Floop。引物由上海Invitrogen公司合成。pg、1Pg、100fg、10fg和1fg,用优化好的LAMP1.3CIAVDNA的提取和模板的制备方法和常规PCR方法同时检测,进而对两者的敏感DNA(RNA)抽提:参照TIANgenDNA性进行比较。(RNA)提取试剂

7、盒说明书,抽提其DNA(RNA),对2结果与分析照菌(毒)株的DNA(RNA)的抽提方法相同。制备CIAVDNA模板:用凝胶回收试剂盒纯化2.1LAMP反应条件的优化回收B3、F3的PCR扩增产物,将PCR产物连人2.1.1反应温度的优化通过对反应温度的优化,pGM-18T载体,用PCR快速鉴定,阳性重组菌送最终确定该LAMP检测方法的最佳反应温度为62大连宝生生物技术有限公司进行测序,在GenBank464℃,加环引物

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