翘嘴红鲌精原干细胞的分离培养及鉴定.pdf

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1、江苏农业科学2015年第43卷第6期-——209·-——曹访，刘莉，采克俊，等．翘嘴红垂白精原干细胞的分离培养及鉴定[J]．江苏农业科学，2015，43(6)：209—211doi：10．15889／j．issn．1002—1302．2015．06．069翘嘴红鲐精原干细胞的分离培养及鉴定曹访，一，刘莉，采克俊，叶金云，．卢中玉(1．浙江省水生生物资源养护与开发技术研究重点实验室／湖州师范学院，浙江湖州313000；2．湖州师范学院，浙江湖州313000；3．浙江省淡水水产研究所，浙江湖州313001)摘要：通过制作、观察翘嘴红鲐(Erythroculterilishaefo

2、rmis)各生长阶段的精巢切片，确定翘嘴红鲴精原干细胞最佳分离时间。采用两步酶消化法分离其精原干细胞，并进行体外初步培养研究，最后通过碱性磷酸酶染色、干细胞标志基因Oct一4RT—PCR扩增进行鉴定。结果显示：7月龄翘嘴红铂精巢为分离精原干细胞的最佳时期，所分离的精原干细胞符合干细胞的形态、增殖及表达特征，且细胞碱性磷酸酶染色呈阳性，支持细胞碱性磷酸酶染色呈阴性，Oct一4基因表达呈阳性。关键词：翘嘴红铂；精原干细胞；分离培养；标志基因中图分类号：s917文献标志码：A文章编号：1002—1302(2015)06—0209—03精原干细胞(spermatogonialstem

3、ceHs，SSCs)具有自我更盒购自碧云天生物技术研究所；Trizol试剂购自Invitrogen公新及分化的潜能，是动物体内唯一能传递遗传信息的干细胞。司；RNA酶抑制剂、M—MLV反转录酶购自Promega公司；SSCs起源于原始生殖细胞(primordialgermcells，PGCs)，存在Taq酶、DNaseI、pMD20一T载体、Oligod(T)15等购自大连于动物的睾丸或者精巢中，是雄性动物精子发生的前体细宝生物工程公司；其他试剂均为国产分析纯。胞⋯。SSCs在医学、畜牧生产学等领域应用前景极为广阔，1．2方法如探究精子的发生机制、治疗雄性不育及制作转基因动物

4、等。i．2．1翘嘴红鲐精巢石蜡切片的制作取各年龄段翘嘴红当前对SSCs研究多集中在体外分离、培养、增殖、诱导分化、鲐精巢，用Bouin氏液固定，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡移植等方面，涉及的物种主要包括小鼠、大鼠。、禽包埋，厚度7txm连续切片，H．E染色，中性树胶封片后显微类。]、灵长类等，关于鱼类SSCs研究相对较少。研究镜下观察、拍照“”。显示，鱼类SSCs细胞相较哺乳类动物及禽类具有更强的可塑1．2．2翘嘴红鲐精原干细胞的分离与培养无菌条件下收性，在一定条件下不但可以分化为精子，甚至可以分化发育为集8～10尾7月龄翘嘴红鲴精巢，用含有双抗的PBS漂洗3卵子“。翘嘴红

5、鲐(Erythroculterilishaeformis)别称太湖白遍，剥离脂肪、白膜等附属组织，将剩余的精巢组织剪成鱼，是“太湖三白”之一，是长江中下游地区重要的经济鱼类，1mm左右的小块，用2．5mL一次性注射器尾部进行碾压，关于其人工繁育、养殖技术等研究已经很多，但是关于其生殖使精巢组织尽量分散，向分散的组织中添加0．1％IV型胶原发育研究较少。本研究以翘嘴红鲐SSCs为研究对象，研究翘酶，26℃消化1．5h，其间每10min轻摇1次以加速消化，收嘴红鲴SSCs分离的最佳年龄段，并进行初步培养，旨在为采集消化液800r／min离心3min，弃上清；剩余组织块用1O倍用生

6、殖细胞移植法开展替代育种研究奠定基础。体积的0．25％胰蛋白酶消化15min，其间用吸管不停吹打，使细胞尽可能游离分散，过200目滤网；用含有10％FBS的培1材料与方法养基终止消化，800r／min离心3rain，弃上清；用DMEM／F121．1材料完全培养基(含10％FBS、100g／mL青霉素、100txg／mL链1．1．1试验用鱼试验所用翘嘴红鲐购自浙江省湖州市菱霉素、1OmLbFGF10g／mLLIF、5s／mLHELPS)重悬湖镇某养殖场，暂养于1．2m×1．0m的孵化桶中，每隔3d细胞，调整细胞浓度为10个／mL，按照1mL／孔的量铺于明更换1次水。胶包被的24

7、孔细胞培养板中，26℃培养2h后加新鲜培养基1．1．2试剂DMEM／F12购自Gibco公司；胰蛋白酶1mL，以后每60h换1次液。(1：250)、胶原酶Ⅳ、青链霉素混合液(100×)购自Solarbio1．2．3碱性磷酸酶(AKP)活性鉴定取培养4d且生长良公司；明胶、HEPES一巯基乙醇购自生工生物工程(上海)好的细胞进行AKP活性检测，按照说明书进行操作。有限公司；胎牛血清(FBS)购自PAA公司；碱性磷酸酶试剂1．2．4SSCs细胞表面标记物的检测分别收集培养2、4、6、8d的细胞，采用Triz