适合猪流行性腹泻病毒敏感复制的Vero细胞株的克隆及应用.pdf

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1、广东农业科学2015年第10期105适合猪流行性腹泻病毒敏感复制的Vero细胞株的克隆及应用蒋智勇，蔡汝健，刘燕玲，张乐宜，李艳，宋长绪(广东省农科院动物卫生研究所／广东省兽医公共卫生公共实验室，广东广州510640)摘要：为了有效提高Vero细胞对猪流行性腹泻病毒(PEDV)的易感性，采用有限稀释法将Vero细胞进行克隆，通过荧光定量RT—PCR方法筛选对PEDV敏感的克隆细胞。结果获得了1株对PEDV高度易感的细胞Vero—S，该细胞株接种PEDVGZ株后培养3d，收获的病毒RNA拷贝数为2．1X109copies／IxL，明显高于Vero母细胞(3．5×1

2、0copies／IxL)。将此Vero—S细胞用于PEDV临床样品的分离获得3株PEDV毒株。构建的PEDV敏感复制的Vero—S细胞株比Vero母细胞更适合PEDV的培养。关键词：猪流行性腹泻病毒；Vero细胞；克隆中图分类号：$859．79+7文献标识码：A文章编号：1004—874X(2015)10—0105—04Cloningandapplication0fVerocellsforthesensitivereplicationn●●1●1●1●0IDorclneeDldemlCnlarrneaVIrUSJIANGZhi-yong，CAIRu-jian，L

3、IUYan-ling，ZHANGLe-yi，LIYan，SONGChang-xu(InstituteofVeterinaryMedicine，GuangdongAcademyofAgriculturalSciences~PublicLaboratoryofVeterinarypublichealthinGuangdongProvinceGuangzhou510640，China)Abstract：ToimprovethesensibilityofVerocellstoporcineepidemicdiarrheavirus(PEDV)，Vcrocellswere

4、clonedbyusingthelimitingdilutionmethodandthesusceptiblecellstoPEDVwereselectedbyquantitativeRT—PCRanalysis．Inresult，oneclone，Vero-S，whichcouldreliablyproducePEDVwithhighgenomiccopynumberswasselectedfromheterogeneousVeroparentalcells．Theviralgenomiccopynumberscouldbeashighas2．1X10copi

5、es／IxLaftertheVero—ScellsinoculatedwithPEDVGZstrainfor3days．ThelevelsofviralgenomiecopynumbersinVero—ScellsweresignificantlyhigherthanthoseinVeroparentalcells(3．5×10copies／IxL)．Weisolated3PEDVstrainsfrom3pigfarmsbyusingtheVero—Scells．TheresultssuggestthattheconstructedVero—Scellsline

6、iSmoresuitabletocultivatePEDVcomparedtoVeroparentalcells．Keywords：porcineepidemicdiarrheavirus(PEDV)；Verocell；cloning猪流行性腹泻病毒(porcineepidemicdiarrheaPED开始在我国大面积流行，给我国养猪业带来了virus，PEDV)属于冠状病毒，是有囊膜的单股正链巨大损失[i-2]。RNA病毒，可导致以呕吐、食欲下降、水样腹泻、脱PEDV在体外细胞中适应性差，繁殖条件复杂，水和哺乳仔猪高致死率为主要特征的猪流行性腹泻在细胞培养中繁

7、殖滴度低，细胞病变不明显，这一直(porcineepidemicdiarrhea，PED)。PED在1971年首是PEDV体外增殖过程的重要技术瓶颈，直接影响次报道于英国，我国从1976年开始陆续有PED的了对该病毒生物学特性基础研究及该病毒相关生物报道，并于1980年首次分离到PEDV。2010年冬季制品的发展。本试验采用有限稀释法将Vero细胞进行克隆，通过荧光定量RT—PCR方法筛选获得了1收稿日期：2014—12—22株对PEDV敏感的克隆细胞Vero—S，从而为PEDV基金项目：广东促进科技服务业发展专项(2010野毒株的分离、体外增殖和生物学特性研究

8、奠定了A04030101