小鼠pOct4-EGFP胚胎干细胞株的构建.pdf

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1、第33卷第5期嘉应学院学报(自然科学)Vo1．33N0．52015年5月JOURNALOFJIAYINGUNIVERSITY(NaturalScience)May2015小鼠pOct4一EGFP胚胎干细胞株的构建张爱霞，赵书策，曾宪录，张秀明(1．嘉应学院生命科学学院，广东梅州514015；2．中山大学中山医学院干细胞与组织工程中心，广州510080)摘要：以建立pOet4一EGFP转基因的小鼠胚胎干细胞(ESC)株，为研究ESC分化提供有力的示踪工具为目的，通过电穿孔法转染小鼠ESC，G418和荧光显微镜下挑选和观察所得阳性克隆，检测所得细胞胚胎干细胞特异性标志物AKP、Oct4

2、及SSEA一1的表达，通过拟胚体(EB)诱导体外分化，RT—PCR检测三胚层的分化，通过Oct4免疫荧光观察pO~t4一EGFPESC的Oct4与GFP的一致性表达，进一步通过诱导pOct4一EGFPESC分化观察GFP的表达情况，并用RT—PCR检测Oct4的表达．结果表明，形态学观察可见所得GFP阳性细胞呈克隆样鸟巢状生长，AKP染色呈强阳性，ESC特异性标志Oct4、SSEA一1表达阳性，RT—PCR结果显示pOct4一EGFPESC具有三胚层的分化能力．pOct4一EGFPESC免疫荧光及细胞分化结果均表明0ct4与GFP的表达一致．本研究成功建立了小鼠pOct4一EGFP

3、胚胎干细胞株，并可用于体外直观监测ESC分化的阶段性变化．关键词：胚胎干细胞；Oct4；绿色荧光蛋白中图分类号：Q24文献标识码：A文章编号：1006一IM2X(2015)05—0065—06胚胎干细胞(embryonicstemcells，ESC)是从哺一]．Oct4属于octamer元件结合转录因子(octamer乳动物早期胚胎内细胞团(innercellmass，ICM)或motifbindingtranscripfionfactor)家族成员，由早期胚胎的原始生殖细胞(primordialgermceUs，Pou5fl基因编码，表达于ESC、卵母细胞、PGCs、PGC)中分

4、离出来，在体外具有无限增殖能力，高度ICM、成体干细胞和成体细胞肿瘤等，随着ESC的分未分化的全能细胞系]．因ESC可在适合的条件化，Oct4的表达下调或消失，异常表达会导致下分化为胚胎或各种类型的成体组织细胞，这为治细胞分化受阻j，因此，Oct4是ESC分化阶段以及疗许多难治性疾病提供了细胞来源和研究工具．但是否正常分化的重要标志分子．本研究拟构建以如果直接将ESC移植受体会导致肿瘤的发生-3J，因Oct4启动子驱动表达绿色荧光蛋白的ESC细胞，为此把ESC分化成特定类型的细胞用于移植成为细研究ESC有效分化提供一种较为直观的监测工具．胞治疗的有效途径，这不仅解决了细胞来源短缺的

5、1材料与方法问题，而且使供体细胞对不同疾病的治疗更具针1．1材料与试剂对性．小鼠ESC细胞系El4．1与含有Oct4启动子的但是，如何对ESC的分化过程进行实时监测和pOet4一EGFP载体由中山大学中山医学院干细胞有效调控，从而达到高效分化特定细胞的目的，是与组织工程中心提供．高糖DMEM培养基购于美国目前研究的难点问题．ESC是否分化受到胞内多种Invitrogen公司；胎牛血清(fetalbovineserum，FBS)基因的严密调控，Oct4基因是其中关键基因之购于美国Hyclone公司；白血病抑制因子(LIF)购于Chemicon公司；免疫组化用一抗Oct一4、GFP及收

6、稿日期：2104一o3—09SSEA一1抗体均购于美国Millipore公司；二抗包括基金项目：广东省教育部产学研结合项目(2012B091100481)作者简介：张爱霞(1977一)，女，山东东营人，讲师，博士，主山羊抗小鼠、山羊抗兔IgG抗体均购于美国R&D公要研究方向：干细胞与再生医学．司；明胶购于美国Sigma公司．嘉应学院学报(自然科学)2015年5月1．2试验方法清洗3次，4％PFA／PBS固定20rain，视情况用1．2．1ESC的体外培养0．02％TritonX100室温穿透细胞20min，再以即用含10％胎牛血清、1mmol／，LL一谷氨酰胺、0．用型二抗宿主血清

7、封闭30min．弃血清后，加入一1mmol／L非必需氨基酸、0．1mmol／LB一巯基乙醇、抗抗体Oct一4(1：200稀释)、SSEA一1(1：100稀1000U／mLLIF的高糖DMEM完全培养液，接种到释)、GFP(1：200稀释)并于4℃孵育过夜．PBS洗2％明胶包被的培养皿中。放在37℃、5％CO2的培涤，再以FITC和Cy3标记相应二抗室温孵育1h养箱中培养，每2d换液1次．后，重复PBS洗涤，以lIxg／mLHoechst33344衬染1．2．2电穿孔转