鲤鱼嗜水气单胞菌的检测与分析.doc

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1、鲤鱼嗜水气单胞菌的检测与分析　　摘要：对从渔场采集患细菌性败血症的濒死鲤鱼进行细菌分离培养及毒力因子测试，应用镀银染色、负染色技术检测菌体。根据细菌的致病力，形态特征及鞭毛生长位置、数目、长短等指标，判断其菌体。结果表明，分离的菌体无杂菌生长，嗜水气单胞菌是鲤鱼败血症的致病菌。　　关键词：鲤鱼；嗜水气单胞菌；毒力因子；菌体；检测与分析　　中图分类号：Ｓ９１７．１文献标识码：Ａ文章编号：0439－８11403－0564-02　　　　ＤｅｔｅｃｔｉｏｎａｎｄAｎａｌｙｓｉｓｏｆＣａｒｐAｅｒｏｍｏｎａｓｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ　　　　ＺＨＡＮＧ

2、Ｗｅｎ－ｌｉa，ＺＨAＮＧＹｕ－ｆｅｎb，ＺＨＡＮＧＸｉｕ－ｊｕｎb　　　　　　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｆｉｓｈｃｏｌｌｅｃｔｅｄｆｒｏｍｆｉｓｈｉｎｇｇｒｏｕｎｄｄｙｉｎｇｏｆｂａｃｔｅｒｉａｌｓｅｐｔｉｃｅｍｉａｗｅｒｅｉｓｏｌａｔｅｄａｎｄwereproceededｂａｃｔｅｒｉａculturing，ｖｉｒｕｌｅｎｃｅｆａｃｔｏｒｓtesting，ｗｉｔｈａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｓｉｌｖｅｒｓｔａｉｎｉｎｇ，ｎｅｇａｔｉｖｅｓｔａｉｎｉｎｇｆｏｒｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆbacterium．Ｔｈｅstrainｗａｓｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄａｃ

3、ｃｏｒｄｉｎｇｔｏｔｈｅｂａｃｔｅｒｉａｌｖｉｒｕｌｅｎｃｅ，ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙａｎｄｆｌａｇｅｌｌａｒ’sｇｒｏｗｔｈｐｏｓｉｔｉｏｎ，ｎｕｍｂｅｒ，ｌｅｎｇｔｈａｎｄｏｔｈｅｒｉｎｄｉｃａｔｏｒｓ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔ，ｔｈｅｓｅｐａｒａｔｅｄbacteriumｇｒｏｗedｗｉｔｈｏｕｔｏｔｈｅｒbacterium，ａｎｄＡｅｒｏｍｏｎａｓｈｙｄｒｏｐｈｉｌａwasｔｈｅpathogenｏｆａｃａｒｐｓｅｐｔｉｃｅｍｉａ．　　Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：carp；Ａｅｒｏｍｏｎａｓｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ；ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ

4、ｆａｃｔｏｒｓ；ｔｈａｌｌｕｓ；ｄｅｔｅｃｔｉｏｎandanalysis　　　　近年来，随着高密度养殖和环境污染等原因，各种鱼类疾病发病率大大增加，其中细菌性败血症是鲤鱼的严重病害之一。感染细菌性败血症的病鱼或死鱼主要症状为两眼突出，腹部膨大，体表有大小不等的红斑，肛门红肿，尾鳍溃烂。少数病变严重的鲤鱼用手触摸体表，鳞片即脱落。剖检病鱼可发现鱼鳃为暗红色，肝脏肿大，大部分呈土黄色，胆囊高度充盈，脾脏呈暗黑色，腹腔有淡红色腹水，黏膜变黑。试验拟找出鲤鱼细菌性败血症的病原菌，通过无菌细菌培养及毒力因子测试，判断菌体形态特征、菌体表面结构与鞭

5、毛形成情况等，为细菌的分类提供检测技术及基础资料。　　１材料与方法　　１．１材料　　１．１．１患病鲤鱼患病鲤鱼采集于唐山市丰南养殖场。　　１．１．２培养基及细菌鉴定条营养琼脂培养基、琼脂斜面培养基、营养肉汤、血琼脂平板、脱脂奶蔗糖胰蛋白胨琼脂平板，参照说明制备使用；ＡＰＩ细菌鉴定条由法国梅里埃公司提供。　　１．１．３仪器日本ＯＬＹＭＰＵＳ公司ＣＨＣ－２１２型光学显微镜；日本日立Ｈ－７６５０型透射电子显微镜。　　１．２方法　　１．２．１细菌分离培养无菌采取发病或濒死鲤鱼的肝、脾、肾，划线接种于普通营养琼脂培养基上，２８℃培养２４ｈ，挑取单

6、个菌落获纯培养物后，转接于普通营养琼脂斜面培养基上，然后移接于营养肉汤试管，置摇床培养１６ｈ，涂片，供鞭毛镀银染色。取营养琼脂斜面培养基上菌体，２８℃培养１６～１８ｈ，制成菌悬液，浓度为１．０×１０８CFU／ｍＬ，用于磷钨酸负染色。　　１．２．２毒力因子检测将分离的菌株接种于血琼脂平板上，２８℃培养２４ｈ，观察溶血情况并挑取单个菌落接种于含１．５％脱脂奶蔗糖胰蛋白胨琼脂平板上，２８℃培养２４ｈ，以在点种菌生长菌落周围出现清晰溶蛋白圈者为阳性。　　１．２．３细菌生化鉴定经ＡＰＩ细菌鉴定条鉴定此菌为嗜水气单胞菌。　　１．２．４鞭毛镀银染色取

7、鞭毛染色液Ａ液０．１ｍＬ加入有塞的试管内，再加入Ｂ液０．１ｍＬ充分混合［１，２］，用酒精灯火焰轻微缓缓加热１０～２０ｓ，稍冷却。这样处理过的混合液染片４０ｓ即可，去离子水缓慢冲洗干净。Ａ、Ｂ液混合物不稳定，加热１０ｍｉｎ内使用。滴加银染液Ｃ液染色，加热至微冒蒸气，染色１０～２０ｓ，去离子水洗净染液，干后镜检。　　１．２．５悬滴法负染色采用２％磷钨酸［３］水溶液，，选用日本进口３００目铜网，制成Ｆｏｒｍａｌ支持膜，厚度１００～２００?�。备好试验操作用无菌带盖玻璃平皿，用１ｍＬ注射器抽取０．１～０．２ｍＬ菌悬液；小心滴于带有Ｆｏｒｍａｌ膜

8、的铜网上；静置２ｍｉｎ，用小片滤纸吸取铜网边缘余液，再静置２ｍｉｎ。用１ｍＬ注射器抽取０．１～０．２ｍＬ染液，滴加染液于带菌体的铜网上，静置１～２ｍｉｎ，小片滤纸吸去铜网边缘染液。自然干燥或距离普通台灯１５