高盐方法提取蒙古黄芪基因组DNA比较分析.doc

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1、高盐方法提取蒙古黄芪基因组DNA比较分析　　摘要：为了提取高质量的蒙古黄芪基因组ＤＮＡ，采用高盐十二烷基硫酸钠法、高盐溴化十六烷基三甲基溴化铵法和高盐低ｐＨ值法，结果表明高盐ＣＴＡＢ法获得的黄芪基因组ＤＮＡ纯度高，能用于ＰＣＲ扩增和限制性内切酶酶切，是提取黄芪基因组总ＤＮＡ的最佳方法。　　关键词：高盐；蒙古黄芪；ＤＮＡ提取　　中图分类号：Ｒ２８２；Ｑ５０３文献标识码：Ａ文章编号：0439－８11403－0595-04　　　　ＣｏｍｐａｒａｔｉｖｅＡｎａｌｙｓｉｓｏｆＨｉｇｈ－ｓａｌｔＭｅｔｈｏｄｓｏｆＧｅｎｏｍｉｃＤＮＡＥｘｔｒａｃｔｉｏｎｆｒｏｍＡｓｔｒａｇａｌｕｓmｅｍｂｒａｎａｃｅｕｓ

2、　　　　ＨＡＮＹａ－ｎａｎ，ＺＨＡＯＸｉｕ－ｊｕａｎ，ＬＩＹａｎ－ｊｕｎ，ＣＡＩＬｕ　　　　　　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｈｉｇｈ－ｓａｌｔＳＤＳ，ｈｉｇｈ－ｓａｌｔＣＴＡＢ，ａｎｄｈｉｇｈ－ｓａｌｔｌｏｗｐＨｖａｌｕｅｍｅｔｈｏｄｓｗｅｒｅｕｓｅｄｔｏｅｘｔｒａｃｔｈｉｇｈｑｕａｌｉｔｙＡｓｔｒａｇａｌｕｓｍｅｍｂｒａｎａｃｅｕｓｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ．ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡｗｉｔｈｔｈｅｈｉｇｈｅｓｔｑｕａｌｉｔｙｗａｓｅｘｔｒａｃｔｅｄｂｙｈｉｇｈ－ｓａｌｔＣＴＡＢｍｅｔｈｏｄ，ａｎｄｗａｓｐｒｅｆｅｒａｂｌｅｅｎｏｕｇｈｔｏｂｅｕｓｅｄａｓＰＣＲｔｅ

3、ｍｐｌａｔｅａｎｄｄｉｇｅｓｔｅｄｂｙｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｅｎｚｙｍｅｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙ；ｔｈｕｓｈｉｇｈ－ｓａｌｔＣＴＡＢｗａｓｔｈｅｂｅｓｔＤＮＡｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄ．　　Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｈｉｇｈ－ｓａｌｔ；Ａｓｔｒａｇａｌｕｓｍｅｍｂｒａｎａｃｅｕｓ；ＤＮＡｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　　　　蒙古黄芪属双子叶植物纲豆科植物，分布于黑龙江、吉林、内蒙古、河北、山西等地，可以补气固表、托毒生肌、利水退肿。治气短心悸、乏力、虚脱、自汗、盗汗、体虚浮肿、慢性肾炎、久泻等疾病［１］。近年来由于环境的恶化、土地盐碱化愈加严重，蒙古黄芪资源逐渐匮乏。因此，高盐环境下蒙古黄芪的生理生化特性及

4、分子生物学研究就变得尤为重要，而进行这些研究的必要前提就是提取高质量的蒙古黄芪基因组ＤＮＡ。提取植物基因组ＤＮＡ的方法有很多，其中高盐提取基因组ＤＮＡ方法的优点是可以将ＤＮＡ与蛋白质、多糖充分分离，对提取含有大量次生代谢产物物种的ＤＮＡ是较为理想的方法［2］。据此，本实验选用了３种高盐方法，即高盐ＳＤＳ法［３］、高盐ＣＴＡＢ法［４］和高盐低ｐＨ值法［５］，比较３种方法的提取效果，以找到黄芪基因组ＤＮＡ的最佳提取方法，为进一步分子生物学研究奠定基础。　　１材料与方法　　１．１材料　　本实验采用种植了两周的蒙古黄芪叶片作为研究对象，蒙古黄芪种子购于内蒙古赤峰市喀喇沁旗牛家营子镇中药材基地。　　１

5、．２仪器　　水浴恒温摇床，台式多功能高速离心机，紫外分光光度计，凝胶成像仪，基因扩增仪。　　１．３无菌苗的种植　　１．３．１种子预处理挑选饱满的黄芪种子，用研钵研成粉末，研磨过程中加入少许沙粒，用７５％的乙醇浸泡３０ｓ，０．１％升汞浸泡５ｍｉｎ，无菌水冲洗３次，最后用无菌水３７℃浸泡３ｈ［６］。　　１．３．２培养基母液配制大量元素１０００ｍＬ，含硝酸钾１９．０ｇ、氯化铵２２．２ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ３．７ｇ、磷酸二氢钾１．７ｇ、无水ＣａＣｌ２３．３ｇ。有机成分２００ｍＬ，含肌醇２．０ｇ、盐酸硫胺０．００２ｇ、盐酸吡哆　　锌０．０１ｇ、烟酸０．０１ｇ、甘氨酸０．０４ｇ。螯合铁２００ｍＬ，含Ｆ

6、ｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ１．１１ｇ、乙二胺四乙酸　　二钠１．５ｇ。微量元素２００ｍＬ，含ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ　　３．４ｇ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ１．７ｇ、Ｈ３ＢＯ４１．２ｇ、ＫＩ０．１７ｇ、　　Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ０．０５ｇ、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ０．００５ｇ、ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ０．００５ｇ。　　１．３．３分装培养基取１００ｍＬ三角瓶，加入２０ｍＬＭＳ培养基。每个三角瓶接种５～６颗种子，人工气候箱光照和暗培育各１２ｈ交替进行，温度设置为℃，湿度为７０％，待发芽后，取长出的叶片作为提取ＤＮＡ的材料。　　１．４黄芪基因组ＤＮＡ的提取方法　　１．４．１高盐ＳＤＳ法［３］取黄芪幼苗的新鲜叶片０．２～０．４

7、ｇ于研钵中，快速加入液氮并将其研成粉末，将粉末转入离心管中，立即加入８０μＬ溶液Ⅰ　　和１６μＬβ－巯基乙醇，置于室温数分钟至解冻；加入２７０μＬ１０％ＳＤＳ，轻轻混匀；６５℃水浴２５ｍｉｎ；将离心管取出后立即置于冰上，并加入１２０μＬ５ｍｏｌ／ＬＫＡｃ反应３５ｍｉｎ。１３０００ｒ／ｍｉｎ，４℃离心２０ｍｉｎ；取上清液，加入０．９倍体积的异丙醇，轻轻混匀后，－２０℃过夜放置。４℃，１３０００ｒ／ｍｉｎ，离心２