《放射免疫技术》PPT课件.ppt

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1、免疫学检验第十九章放射免疫技术放射免疫技术的基本概念及类型放射标记物的鉴定与纯化。RIA和IRMA的测定原理及关键技术。RIA和IRMA的临床应用与评价本章要点目　录放射性核素和放射性标记物的制备1放射免疫分析性2免疫放射分析3放射免疫技术是将放射性核素高敏感的示踪特点和抗原抗体反应的高特异性特点相结合的一种体外测定超微量物质的新技术。其基本模式是应用放射性核素标记抗原或抗体，通过免疫反应进行定量测定。具有灵敏度高、特异性强、重复性好、样品及试剂用量少、操作简便且易于标准化等优点，在医学检验中得到了广泛应用。放射免疫技术根据其方法学原理的不同主要有两种类型：RIA和IRMA。前言

2、第一节放射性核素和放射性标记物的制备放射性核素作为放射性免疫技术的标记物，选择何种放射性核素以及如何制备放射标记物（将放射性核素与抗原或抗体连接），是建立放射免疫技术的基础。一、放射性核素的基本知识基本概念指在自然条件下可发生自发性的转化，由一种放射性核素转变成另一种放射性核素，并同时释放射线（α、β、γ），又称为放射性衰变。基本类型依据其衰变方式α衰变、β衰变、γ衰变最常用的放射性核素是125I125I的优点化学性质比较活泼，标记方法简单，且容易获得高比活性的标记物；在衰变过程中产生γ射线，便于测量且效率高；半衰期适中（60天左右），且废弃物较容易处理。125I的缺点用125I

3、取代H，可能使原物质免疫活性受到影响；易因发生辐射损伤而使标记抗原变性；作为商品化试剂的产品货架期较短。放射性核素放射活性的检测利用射线照射闪烁体（NaI晶体），导致晶体分子激发，在退激发时，闪烁体发出一定波长的荧光；再由光电倍增管将极微弱的荧光转换成光电子并放大107倍；从光电倍增管输出的电信号经过放大器放大，经单道分析器甄别处理，并在定标器上显示。二、放射性核素标记抗原抗体方法主要包括间接标记法直接标记法（氯胺T法）125I-125I或125I+125I-标记物（混合物）Ch-T、LPO氧化取代反应（一）直接标记法——氯胺T法（Ch-T）氯胺T将125I的I－氧化为I+，I+

4、取代蛋白质酪氨酸苯环的氢，形成稳定的放射标记物（二碘酪氨酸），最后加入偏重亚硫酸钠（还原剂）终止反应。使用无还原剂的高比放射性碘源被标记物用量要少Ch-T用量要低控制总反应体积<200μl反应时间1分钟~2分钟弱碱性反应条件（二）间接标记法预先将125I用Ch-T法标记琥珀酰胺酯，制成的125I化脂功能基团可与蛋白分子上的氨基酸残基反应，从而使待标记物被碘化。三、放射标记物的纯化与鉴定（一）放射标记物的纯化因游离的125I与125I标记抗原（抗体）分子的大小相差悬殊，故采用凝胶层析即可进行分离纯化聚合、损伤物标记蛋白游离125I比放射活性高比放射性高纯度完整免疫活性放射化学纯度单

5、位标记物中结合于被标记物上的放射性占总放射性的百分率应大于95%免疫活性标记物与抗体结合的能力标记物与过量抗体反应百分比该值越大,标记物免疫活性好（二）放射标记物的鉴定计算法自身置换法比放射活性单位化学量标记物中所含的放射性强度单位：Ci/gmCi/mgCi/mmol比放射性过高，将影响标记物免疫活性比放射性－计算法结果欠准，计算简便依据标记反应中放射性核素的利用率（标记率）来计算标记物的比放射性.比放射性－自身置换法比较标记抗原与标准抗原的免疫活性来测定标记物的比放射性。作一条常规的RIA标准曲线，反应体系包括定量标记抗原、不同浓度的非标记标准品抗原、限量抗体；同时另作一条不加

6、非标记标准品、只加抗体和不同剂量的标记抗原的自身置换曲线。自身置换曲线标准曲线反应平衡后，测定B/T%。若从两条曲线上取一点相同的B/T%，则（标记物+标准品）标准曲线=（标记物）自身置换曲线。由此便可直接计算标记抗原的含量，并进一步求得比放射活性。自身置换法测定标记化合物的比放射活性，只适用于RIA的标记抗原。使用时应注意：①标记物与未标记物对抗体（受体）的亲和力应相同；②非特异性结合应较小，且计算时应扣除；③制备标准曲线与自身置换曲线时，操作步骤应相同，特别是B与F分离的条件要一致。第二节放射免疫分析放射免疫分析（RIA）是以放射性核素标记的抗原（Ag*）与未标记抗原（Ag）

7、竞争结合特异抗体（Ab）来对待检样品中的抗原进行定量测定的一种技术。一、检测原理RIA属于竞争性分析，其基本原理是由于Ag*和Ag（待测物Ag)对特异性抗体具有相同的结合力，当三者同时存在于同一反应体系时，Ag*和Ag相互竞争结合特异性抗体。Ag*和Ag具有等同的与Ab结合能力Ab限量，Ag*定量,Ag*和Ag的量大于Ab结合位点，二者通过竞争方式与Ab结合；随着Ag增加，Ag*与Ab结合形成Ag*Ab复合物的放射量降低,二者变化成函数关系。(标准Ag/样品Ag)二、方法与类型非