质粒DNA的提取和鉴定.ppt

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1、质粒DNA的提取和鉴定实验二十四目的掌握碱裂解法提取质粒的方法了解质粒酶切鉴定原理质粒DNA的提取方法方法：碱裂解法；煮沸裂解；羟基磷灰石柱层析法，质粒DNA释放法；酸酚法等。概括起来主要是用非离子型或离子型去污剂、有机溶剂或碱进行处理及用加热处理所有分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离质粒DNA(有时还要求纯化质粒DNA，根据实验所需)选择哪一种方法主要取决于以下几个因素：质粒的大小、大肠杆菌菌株、裂解后用于纯化的技术和实验要求碱裂解法基本原理：1.当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒D

2、NA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不复性而呈絮状，离心时可沉淀下来2.在一定电场强度下，DNA分子的迁移取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型(相对分子质量不同的DNA片段泳动速度不一样)，且DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系。因此，凝胶电泳不仅可分离不同相对分子质量的DNA，也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子：其中超螺旋结构泳动最快，其次为线性结构，最慢的可能是复制中间体（没有复制完的两个质粒连在一起），而不是开环结构（用EcoRI来线性化质粒后再进行琼脂糖电泳，就会看到线性质粒DNA的位置与这三

3、条带的位置不一样）3.溴化乙锭是一种荧光染料(3,8-二氨基-5-乙基-6苯基菲啶溴盐)，其分子可以嵌入到核酸的碱基对之间，在紫外线的激发下，发出橙色荧光一细菌培养与质粒扩增1.挑单克隆E.coli菌株接种到斜面培养基上（活化菌种），37℃过夜培养2.从斜面培养基上挑E.coli菌株，接种于25毫升液体培养液内（含氨苄青霉素），37℃振荡过夜培养3.从中取4毫升种子菌液于含M9培养基中（含Ap），37℃振荡培养3-4小时（OD600＝1.0）二质粒提取取1.5ml培养物倒入Eppendorf管中，12000r/min，4℃，30sec吸去培养液，使细胞沉淀尽可能干燥将细菌沉淀悬

4、浮于100μl预冷的溶液I中，剧烈振荡加200μL溶液II（新鲜配制），盖紧Eppendorf管，快速颠倒5次，混匀内容物，将Eppendorf管放在冰上5.加入150μL溶液III（冰上预冷），盖紧管口，颠倒数次使混匀，冰上放置5min6.12000r/min，离心5min，将上清夜转至另一Eppendorf管中7.向上清夜加入2倍体积乙醇，混匀后，室温放置5-10min。12000r/min离心5min。倒去上清夜，把Eppendorf管倒扣在吸水纸上，吸干液体8.用1ml70%乙醇洗涤质粒DNA沉淀，振荡并离心，倒去上清夜，真空抽干或空气中干燥9.50μLTE缓冲液，使

5、DNA完全溶解（-20℃保存）酶切鉴定10μL溶液+10×内切酶缓冲液2μL+5～10U酶到一Eppendorf管37℃，1-2h加2μL的反应中止液。电泳：1.1％Agrosegel的制备2.上样3.电泳4.紫外灯下观察和拍照思考题染色体DNA与质粒DNA分离的主要依据是什么？参考答案纯化DNA的方法主要依据染色体DNA比质粒DNA分子大得多，而且染色体DNA被断裂成线状分子，但质粒DNA为共价闭环结构，当加热或用酸、碱处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生变性，共价闭环的质粒DNA在冷却和回到中性pH时即恢复其天然构象注意EB是诱变剂，配制和使用EB染色液时，应带乳胶手

6、套或一次性手套，并且不要将该染色液洒在桌面或地面上，凡是沾污EB的器皿或物品，必须进行清洗或弃去