实验九 凝胶层析分离蛋白质.doc

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1、实验九凝胶层析分离蛋白质一实验目的了解凝胶层析的基本原理，并学会用凝胶层析分离纯化蛋白质二实验原理凝胶层析也称凝胶过滤、凝胶过滤层析、分子排阻层析和分子筛选层析。凝胶是具有一定孔径的网状结构物质，凝胶层析是一种分子筛选效应，主要用于分离分子大小不同的生物分子以及测定其相对分子质量。相对分子质量小的物质可通过凝胶网孔进入凝胶颗粒内部，而相对分子质量大的物质不能进入凝胶内部，被排阻在凝胶颗粒外，随着洗脱的进行，相对分子质量小的物质由于进入凝胶内部，不断地从一个网孔穿到另外一个网孔，这样“绕道”而移动，走的路程长，下来得慢（迁移速度慢），而相对分子质量大的物质不能

2、进入凝胶内部即随洗脱液从凝胶颗粒之间的空隙挤落下来，走的路程短，下来的快（迁移速度慢），这样就可以达到分离的目的。三实验器材1.层析柱1cm×90cm2.恒流泵。3.紫外检测仪。4.部分收集器5.记录仪6.试管等普通玻璃皿四实验试剂1.待分离样品：胰岛素、牛血清蛋白。2.葡聚糖凝胶sephadexG-753.蓝色葡聚糖20004.洗脱液：01.mol/L，PH6.8磷酸缓冲液五实验方法1.凝胶的处理sephadexG-75干粉经蒸馏水室温充分溶胀24h，或沸水浴中3h，这样可大大缩短溶胀时间，而且可以杀死细菌和排除凝胶内部的气泡。溶胀过程中注意不要过分搅拌，

3、以防颗粒破碎。凝胶颗粒大小要求均匀，使流速稳定凝胶充分溶账后用倾泌法将不易沉下的较细的颗粒除去。将溶胀后的凝胶抽干，用10倍体积的洗脱液处理约1h，搅拌后继续用倾泌液除去悬浮的较小的细颗粒。2.装柱将层析柱垂直装好，关闭出口，加入洗脱液约1cm高。将处理好的凝胶用等体积洗脱液搅成浆状，自柱顶部沿管内壁缓缓加入柱中，待底部凝胶沉积约1cm高时，再打开出口，继续加入凝胶浆，至凝胶沉积至一定高度（约70cm）即可。装柱要求连续，均匀，无气泡，无“纹路”。3.平衡将洗脱液与恒流泵相连，恒流泵出口端与层析柱入口相连，用2-3倍床体积的洗脱液平衡，流速为0.5ml/mi

4、n。平衡好后在凝胶表面放一片滤纸，以防加样时凝胶被冲起。柱装好和平衡后可用蓝色葡聚糖2000检查层析行为，在层析柱内加1ml(2mg/ml)蓝色葡聚糖2000，然后用洗脱液进行洗脱（流速0.5ml/min）,若色带狭窄并均匀下降，说明装柱良好，然后再用2倍床体积的洗脱液平衡。4.加样与洗脱将柱中多余的液体放出，使液面刚好盖过凝胶，关闭出口，将1ml样品沿层析柱管壁小心加入，加完后打开底端出口，使液面降至与凝胶面相平时关闭出口，用少量洗脱液洗柱内壁2次，加洗脱液至液层4cm左右，按上恒流泵，调好流速（0.5ml/min），开始洗脱。上样的体积，分析用量一般为床

5、体积的1%~2%，制备用量一般为床体积的20%~30%。5.收集与测定用部分收集器收集洗脱液，每管4ml。紫外检测仪280nm处检测，用记录仪或将检测信号输入色谱工信站系统，绘制洗脱曲线。6.凝胶柱的处理一般凝胶用过后，反复用蒸馏水通过柱（2~3倍体积）即可，若凝胶有颜色或比较脏，需用0.5mol/LNaCl洗涤，再用蒸馏水洗。冬季一般放2个月无长霉情况，但在夏季如不用，则要加0.02%的叠氮钠防腐。六注意事项装柱时要注意凝胶的流速，不宜过快，同时要保证凝胶能充分的沉淀且分布的比较均匀。凝胶溶胀所用的溶液应与洗脱用的溶液相同，否则由于更换溶剂，凝胶体积会发生

6、变化而影响分离效果。样品的浓度和加样量的多少。是影响分离效果的重要因素。样品浓度应适当大，但大分子物质的浓度大时，溶液的黏度也随之变大，会影响分离效果，要兼顾浓度与黏度两方面。加样量和加样体积越少分离效果越好，加样量一般为柱床体积的1%-2%，制备用量一般为柱床体积的20%-30%。凝胶用完后可再加入防腐剂低温保存。叠氮钠属于有毒性物质，在使用过程中需注意安全。七思考题1．对于蛋白质的分离纯化，目前研究使用较多的还有哪些方法？2．凝胶层析的主要原理是什么？3．装柱的要点有哪些？怎样检查柱是否装的均匀？影响分离效果的主要因素有哪些？