实时荧光定量PCR技术课件.ppt

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1、PCR技术即聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction），PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：

2、DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。重复循环变性--退火--延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。反应过程变性退火延伸实时荧光定量PCR技术（RT-PCR,QPCR）荧光定量PCR技术指在PCR反应中加入荧光基团，通过连续监测荧光信号出现的先后顺序及信号强弱的变化，及时分析目

3、的基因的初始量。在实时荧光定量PCR中，对整个PCR反应过程进行实时检测和连续分析扩增相关荧光信号，随着反应的进行，检测到的荧光信号的变化可以绘制成一条曲线。曲线一般分为基线期，指数增长期，线性增长期和平台期。指数增长期平台期线性增长期基线期两个概念一，荧光阈值是在荧光扩增曲线指数增长期设定的一个荧光强度标准。一般荧光阈值设置为3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，但实际应用时要结合具体情况来综合考虑。二，Ct值为扩增曲线与阈值线的交点所对应的循环次数，即Ct值与荧光阈值有关。实时荧光定量PCR技术的数学原理理

4、想的PCR反应：Xn=X0×2n非理想的PCR反应：Xn=X0(1+Ex)n方程式两边同时取对数得:logXn=log(X0(1+Ex)n)整理方程式得:logX0=(-log(1+Ex))×n+logXn将C(t)和达到C(t)值时终产物的量Xc(t)带入上式得：logX0=(-log(1+Ex))×C(t)+logXc(t)C(t)=-logX0/log(1+Ex)+logXc(t)/log(1+Ex)对于一个特定的反应来说，Ex是恒定的，即，初始浓度的对数与循环数呈线性关系n：扩增反应的循环次数Xn：第n次循环

5、后的产物量X0：初始模板量Ex：扩增效率TaqMan探针荧光探针的一种，基于荧光共增能量转移的原理：当某个荧光基团的发射谱与另一个荧光基团的吸收光谱重叠，且两个基团距离足够近时，能量可以从短波长（高能量）的荧光基团传递到长波长（低能量）的荧光基团，这个过程称为荧光共振能量转移(FRET),实际相当于短波长荧光基团释放的荧光被屏蔽。TaqMan探针利用Taq酶的5`外切活性，即Taq酶具有天然的5`-3`核酸外切酶活性，能水解双链DNA5`端的核苷酸。依据目的基因设计一条能与之特异杂交的探针，5`端标记报告基团Repo

6、rter，3`端标记淬灭基团Quencher，正常情况下两个基团的空间距离很近，构成FRET关系，荧光基团信号被淬灭。PCR扩增时，引物与探针结合到模板上，探针位于上下游引物之间。当扩增延伸到探针结合的位置时，Taq酶利用5`-3`外切酶活性，将探针5`端连接的荧光分子从探针上切割下来，破坏了两个荧光分子的FRET关系，从而发出荧光。反应过程MGB探针新型TaqMan探针，其3`端采用了非荧光性的淬灭基团，吸收报告基团的能量后并不发光，大大降低本底信号的干扰。此外MGB探针3`端还连接了一个小沟结合物--二氢环化吲哚

7、卟啉-三肽，可以大大稳定探针与模板的杂交，提高探针Tm值，使得较短的探针也能达到较高的Tm值，淬灭效果更好，荧光背景更低。此外，还其它非荧光类淬灭基团如BHQ1，BHQ2等。荧光标记组合报告荧光:6-FAM、JOE、VIC、NED、CY3、TexasRed、CY5淬灭荧光:MGB-NFQ、TAMRA、BHQ参比荧光:ROX报告荧光基团淬灭(荧光)基团FAM野生型WTAMRA,BHQ1,MGBVIC，JOE，HEX突变型MTAMRA,BHQ1,MGBROX内参BHQ2,MGB常用的荧光组合：校准物理误差:参比荧光(RO

8、X)MasterMix中ROX浓度固定ROX不参与PCR扩增，信号强度只与MasterMix用量有关ROX的功能：校准物理误差–耗材质量、管盖厚度、透光性能–反应体系监控：蒸发、操作荧光定量PCR过程一体系配制组分名称作用10×buffer（Tri-Hcl、(NH4)2SO4、K+、Mg2+等）缓冲液-提供反应环境引物mixPCR反应的出发点探