实验叶绿素的提取理化性质和含量测定课件.ppt

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1、实验叶绿素的提取理化性质和含量测定1.实验目的1）掌握叶绿素的提取及其含量测定的方法2）了解叶绿素的理化性质2.实验原理2.1用含水的有机溶剂提取叶绿素2.2叶绿素的物理性质吸收光谱荧光现象2.3叶绿素的化学性质取代反应皂化反应2.1用含水的有机溶剂提取叶绿素亲水的卟啉环的“头部”:镁原子居于卟啉环的中央，带正电性，与其相联的氮原子则偏向于带负电性，因而卟啉具有极性，是亲水的，可以与蛋白质结合。亲脂的叶绿醇的“尾巴”:叶醇是由四个异戊二烯单位组成的双萜，是一个亲脂的脂肪链，它决定了叶绿素的脂溶性。2.2叶绿素的物理性质2.2

2、.1吸收光谱2.2.2荧光现象2.2.3含量测定2.2.1叶绿素的吸收光谱红光区：640~660nm篮紫光区：430~450nm胡萝卜素和叶黄素：400~500nm不用蓝光区测叶绿素含量。2.2.2荧光现象透射光下反射光下叶绿素溶液在透射光下呈绿色，在反射光下呈红色的现象。分子吸收的光能有一部分消耗于分子内部的振动上，发射的荧光的波长总是比被吸收光的波长要长叶绿素吸收红光后处于第一单线态，叶绿素分子要从第一单线态返回基态所发射的光称为荧光。2.2.3含量测定叶绿素a、b在红光区的最大吸收峰分别位于663nm和645nm；叶绿

3、素a、b在652nm处有相同的比吸收系数（34.5），测OD652求出叶绿素a、b总量。故叶绿素浓度C＝OD652/34.5(mg/ml)叶绿素的含量（mg/g）=[叶绿素的浓度×提取液体积×稀释倍数]/样品鲜重2.3叶绿素的化学性质2.3.1叶绿素的结构2.3.2取代反应2.3.3皂化反应2.3.1叶绿素的结构叶绿素a与b很相似，不同之处仅在于Chla第二个吡咯环上的一个甲基(-CH3)被醛基(-CHO)所取代即Chlb。2.3.2取代反应2.3.2.1稀酸去镁铜代2.3.2.2浓酸去镁水解卟啉环中的Mg处于不稳定的状态，

4、可被H+、Cu2+、Zn2+等离子取代。2.3.2.1稀酸叶绿素溶液与稀酸(如:草酸)作用，H+取代Mg后的产物为褐色的去镁叶绿素；去镁叶绿素与Cu2+或Zn2+作用，Cu2+等离子取代后的产物为深绿色的铜代叶绿素等；2.3.2.2浓酸叶绿素溶液与浓酸(如:盐酸)作用，除了代换Mg外，可使去镁叶绿素迅速分解出叶绿醇，并形成褐绿色的去镁叶绿酸。叶绿素→去镁叶绿素→铜代叶绿素（稳定而不易降解，常用醋酸铜处理来保存绿色植物标本）2.3.3皂化反应叶绿酸是二羧酸，其中一个羧基被甲醇酯化，另一个被叶绿醇酯化。叶绿素是叶绿酸的酯，能发生

5、皂化反应。叶绿素与碱皂化形成的叶绿素盐能溶于水，极性增大。皂化分层叶绿素的盐形成以后，因分子极性增大，易溶于稀酒精溶液中，不能进入苯层；而类胡萝卜素在苯中的溶解度大于在醇溶液中一部分苯分散在水中形成乳胶体，出现一层乳白色的溶液低温下发生皂化反应的叶绿体色素溶液，易乳化而出现白色絮状物，溶液浑浊，且不分层。3材料、试剂与配备1材料菠菜叶片2仪器设备研钵，漏斗，剪刀，试管，试管夹，容量瓶(25ml,50ml)，分光光度计，水浴锅等3试剂95%乙醇，苯，浓盐酸，36%乙酸，CuSO4，MgCO3，石英砂叶绿体色素提取称取新鲜去大叶

6、脉的菠菜叶片3g，剪碎放入研钵中，加少量石英砂和碳酸镁及5ml95％乙醇，研成均浆，过滤入25ml容量瓶，分别用5ml95％乙醇冲洗研钵3次，冲洗液同样过滤，收集滤液，倒入容量瓶中，最后用95％乙醇定容至25ml，放入暗处备用。2.叶绿素的荧光现象取叶绿素提取液2ml放入试管中，在直射光下观察溶液的透射光及反射光的颜色有何不同？3.光对叶绿体色素的破坏作用取两支试管，各加入叶绿体色素提取液2ml，一管放在直射光下，另一管放在黑暗处，1～2h后观察两管溶液颜色有何变化？4.实验步骤4.叶绿素的皂化作用3ml提取液+1ml20%

7、NaOH-甲醇（摇匀）冷却+3ml苯（摇匀）+3ml蒸馏水（逐滴加，摇匀）静置，观察分层现象。下层是稀的乙醇溶液，其中溶有皂化的叶绿素a和b（以及少量的叶黄素）；上层是苯溶液，其中溶有黄色的胡萝卜素和叶黄素。对照：另取3ml叶绿体色素提取液，加入2ml苯和2ml蒸馏水观察与皂化的叶绿素有何不同？60℃水浴3min5.H+和Cu2+对叶绿素分子中Mg2+的取代作用1）吸取叶绿体色素提取液2ml放入试管中，逐滴加入36%乙酸数滴，摇匀，观察溶液颜色的变化。2）当溶液变褐色后，倾出一半于另一试管中，投入几粒醋酸铜粉，水浴加热，观察

8、溶液颜色变化，与未加醋酸铜（同时加热）的一管相比较。3）吸取叶绿体色素提取液2ml放入试管中，逐滴加入浓盐酸，观察颜色变化。6.叶绿体色素含量测定吸取叶绿体色素提取液5ml，用95%乙醇定容至50ml。以95%乙醇为空白对照，在波长652nm下测定吸光度，并计算总叶绿素的浓度。最后，根据下