重庆大学 研究生植物组培.doc

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1、重庆大学研究生专业实验教学实验报告书实验课程名称：植物基因组DNA的提取实验指导教师：李正国学院：生物工程学院专业及类别：生物学（学术）学号：20131902031姓名：向征实验日期：2014.5.25成绩：重庆大学研究生院制一、实验目的通过本实验学习从植物组织中提取DNA的方法和实验技术。二、实验仪器设备材料：番茄叶片仪器：1.高速离心机2．恒温水浴锅3．高压灭菌锅4.琼脂糖凝胶电泳系统5.凝胶成像仪试剂：1TEBuffer2Lysissolution3氯仿410×concentratedsolution51.2MNaclsolution6乙醇7去离子水81%琼脂糖91×

2、TBE电泳缓冲液。三、实验原理利用液氮对植物组织进行研磨，从而破碎细胞。TEBuffer即tris-EDTA缓冲液，能抑制DNA酶的活性。Lysissolution即细胞裂解液，含有的CTAB，1MTris－HCl，NaCl，0.5MEDTA等成分。CTAB(十六烷基三乙基溴化铵)是一种去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中（（0.7mol/LNaCl）是可溶的，当降低溶液盐浓度到一定程度（0.3mol/LNaCl）时，从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB-核酸的复合物与蛋白，多糖类物质分开。再用氯仿抽提的方法去除蛋白。用10×concentratedso

3、lution将所得DNA浓缩，最后将得到的DNA溶液经乙醇沉淀，去离子水洗脱。四、实验内容1)称取100mg幼嫩叶片，液氮磨样，放于2mL离心管，用200μLTEBuffer重悬；2)加入400μLLysissolution，65℃水浴10min，其间混匀2-3次；3)迅速加入600μL氯仿，轻柔颠倒3-5次，于4℃，10000rpm，离心2min；4)准备沉淀溶液：80μL10×concentratedsolution,加入720μL去离子水，并混匀备用；5)将上清液转入新的离心管，加入800μL新鲜的4)步骤所准备的溶液，轻柔混匀若干次（1-2min），于4℃，1200

4、0rpm，离心2min；6)去除上清液，不晾干，用100μL1.2MNaClsolution溶解DNA沉淀并轻柔涡旋；7)加入300μL预冷的乙醇之后，置于-20℃沉淀30min，于4℃，12000rpm，离心5min；去掉乙醇，放置空气中晾干；8)用30μL灭菌的去离子水溶解DNA并轻柔涡旋，立即存放-20℃冰箱备用。五、实验数据番茄叶片基因组DNA电泳图六、数据处理及结果分析B代表本组结果。1、上图是分别是A、B组所提番茄叶片基因组DNA电泳结果，所用Maker为MakerⅢ。从电泳图上可以看出，这两组所提的DNA质量均较好，DNA条带清楚、单一，效果较好。2、提取的番

5、茄叶片基因组DNA片段大小在5kb左右，条带比较清晰，亮度较高，但仍然有一定的降解，致使在下方形成了一条抹带。3、在离点样孔很近的地方无带出现，表明无蛋白污染。七、实验小结1.在磨样过程中应将样品磨得很细，直至样品发白时再将其装入管中，以便DNA能够很好地提取出。2.注意移液器的正确使用。3.由于植物细胞中含有大量的DNA酶，因此，除在抽提液中加入EDTA抑制酶的活性外，第一步的操作应迅速，以免组织解冻，导致细胞裂解，释放出DNA酶，使DNA降解。4.提取植物基因组DNA的时候，要加入适量的RNA酶。