核酸分子杂交技术核酸分子杂交的基本原理课件.ppt

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1、核酸分子杂交技术第一节核酸分子杂交的基本原理具有互补序列两条单链核酸分子在一定条件下按碱基互补配对原则退火形成双链的过程。杂交的双方是待测核酸和已知核酸序列,已知核酸序列称探针。核酸杂交+一、DNA变性与复性(一)DNA变性1、定义:某些理化因素导致两条DNA链间的氢链断裂变为单链的过程,称DNA变性2、变性的方法:(1)热变性:温度升高到90~100℃时,双链核酸分子链间的氢键完全断裂。(2)酸碱变性:pH值低于3或高于10时,双链核酸分子链间的氢键断裂。(3)化学试剂变性:如尿素、甲酰胺、甲

2、醛等使双链核酸分子链间的氢键断裂。(二)复性定义:变性的单链核酸分子在一定条件下按碱基互补原则重新结合为双链核酸的过程,称复性或杂交。具有互补序列的两条单链核酸都可互补形成双链:DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA、寡核苷酸/DNA和寡核苷酸/RNA。二、影响杂交的因素1.核酸分子的浓度和长度2.温度:比Tm低25℃~30℃较适宜3.离子强度:离子强度↑→杂交反应率↑4.杂交液中的甲酰胺甲酰胺能降低核酸杂交的Tm,含30%—50%甲酰胺的杂交溶液温度能降低到30—42℃。使用甲酰胺的优

3、点:①低温下探针更稳定;②能更好地保留非共价结合的核酸。5、核酸分子的复杂性:(1)核酸的复杂性是指存在于反应体系中不同顺序的总长度(2)Cot½与反应体系中核酸复杂性成正比(3)两个DNA样品浓度绝对一致时,变性后的相对杂交率取决于DNA的相对复杂性6、非特异性杂交反应:(1)杂交前封闭非特异性杂交位点,减少其对探针的非特异性吸附(2)常用的封闭物有两类:即非特异性DNA和高分子化合物。如鲑精DNA或小牛胸腺DNA,Denharts溶液或脱脂奶粉第二节探针一、探针的种类基因组DNA探针cDNA

4、探针RNA探针寡核苷酸探针基因组DNA探针从基因组DNA文库中选取某一基因片段↓与载体连接(质粒、噬菌体)↓克隆(PCR扩增)↓酶切优点:①无性繁殖、制备方法简单;②不易降解(与RNA比较);③标记方法成熟。cDNA探针(complementaryDNA)↓S1核酸酶切平两端优点:不含内含子及高度重复序列,但不易获得↓克隆通过逆转录加接头↓限制酶粘性末端↓双链cDNA↓载体连接优点:杂交效率高,稳定性高,非特异性杂交较少,未杂交探针可用RNase降解,减少本底的干扰。缺点:易降解,标记方法复杂R

5、NA探针:检测DNA和mRNA寡核苷酸探针优点:①可根据需要合成相应序列;②探针短,序列复杂性低,分子量小,因此杂交时间短;③长度只有10—50bp,该识别序列内1个碱基的变化可明显降低杂交Tm值。④可大量合成,价格低,能够用酶学或化学方法进行非放射性标记。二、标记物(一)理想标记物应具备的特性:高度灵敏性不影响碱基配对的特异性不影响探针分子的主要理化性质对酶促反应活性无影响或影响不大检测方法具有高度灵敏性和高度特异性(二)标记物种类核素标记物:32p、35s、3H非核素标记物半抗原:生物素、地

6、高率配体:生物素是亲和素的配体荧光素:异硫氰酸荧光素、罗丹明等化学发光探针:标记物与某种底物反应发光,如生物素酰化的碱性磷酸酶可使发光底物发光三、标记方法体内标记法:将核素标记的化合物作为合成代谢的底物,在细胞合成代谢时使核素掺入到新合成的核酸分子中,如3H-胸苷可掺入到DNA中,3H-尿苷可掺入到RNA中体外标记法:化学标记法:标记物分子上的活性基因与探针分子上的某些基因反应,标记物直接结合到探针分子上酶促标记法:标记物预先标记核苷酸,然后利用酶促法将标记的核苷酸掺入到探针上四、探针的纯化1、

7、乙醇沉淀法:无水乙醇可以沉淀DNA片段,可去除dNTP和蛋白质2、凝胶过滤柱层析法:利用凝胶的分子筛作用,将大分子DNA和小分子dNTP、磷酸根离子及寡核苷酸(<80bp)等物质分离,常用凝胶基质是SephadexG-503、微柱离心法:其原理与上述凝胶过滤柱层析法相同,不同的是上述采用洗脱的方式纯化探针,而此法则是利用离心的方式来纯化探针第三节核酸分子杂交的方法按待测核酸是否固定在固相支持物上分:固相杂交southern印迹杂交northern印迹杂交斑点杂交原位杂交液相杂交一、Souther

8、n印迹杂交(一)待测核酸样品的制备1、裂解或破碎细胞2、抽取纯化基因组DNA3、限制酶消化DNA为大小不同的DNA片段(二)待测DNA样品的电泳分离1、琼脂糖浓度:分离大片段用低浓度胶分离小片段用高浓度胶2、凝胶电泳:凝胶具有分子筛效应,大分子DNA泳动慢,小分子DNA泳动快,大小相同的分子处于同一条带3、分子量标准:经HindⅢ消化的λDNA,杂交所用分子量标准可用核素标记(三)凝胶中核酸的变性(碱变化)凝胶置于NaOH溶液中使DNA变性断裂为较短的单链DNA,中性缓冲液中和凝胶中的缓冲液(四

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