第四章蛋白质的稳定性.ppt

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1、第四章蛋白质的稳定性和稳定化第一节蛋白质的稳定性一、蛋白质的稳定性指的是蛋白质抵抗各种因素的影响，保持其生物活力的能力。二、蛋白质稳定性的分子原因1、金属离子、底物、辅因子和其它低分子量配体的结合作用。金属离子由于结合到多肽链的不稳定部分（特别是弯曲处），因而可以显著增加蛋白质的稳定性。当酶与底物、辅因子和其它低分子量配体相互作用时，也会看到蛋白质稳定性的增加。2、蛋白质-蛋白质和蛋白质-脂的作用在体内，蛋白质常与脂类或多糖相互作用，形成复合物，从而显著增加蛋白质稳定性。当蛋白质形成复合物时，脂分子或蛋白质分子稳定到疏水簇上，因而防止疏水簇与溶剂的接触，屏蔽了蛋白

2、质表面的疏水区域，从而显著增加蛋白质稳定性3、盐桥和氢键蛋白质中盐桥的数目较少，但对蛋白质稳定性贡献很显著。嗜热脱氢酶亚基间区域有盐桥协作系统，这是嗜温脱氢酶没有的。因此嗜热酶的催化活力的变性温度和最适温度都比嗜温酶高出约20℃。用定点突变法定性定量地测定了引入的氢键对蛋白质的稳定性的贡献，发现加入的氢键与蛋白质稳定性无关。4．二硫键大分子的分子内交联可增强其坚实性，并提高其在溶液中的稳定性。稳定化指的是熵性质：由于交联即蛋白质中形成二硫键，伸展蛋白质的熵急剧降低物质的熵是它所处状态的分子混乱度物质的熵是它所处状态的分子混乱度(也称无序度)的度量。熵值小的状态对应

3、比较有序的状态,熵值大的状态对应比较无序的状态。一种物质从固态到液态到气态,分子热运动的混乱程度依次增强,而熵值也依次增大。5、对氧化修饰敏感的氨基酸含量较低结构上重要的氨基酸残基（如活性部位氨基酸）的氧化作用是蛋白质失活的最常见的机理之一。半胱氨酸的巯基和色氨酸的吲哚环，对氧化特别敏感，因此，这些不稳定氨基酸的数目，在高度稳定的嗜热蛋白质中比在相应的嗜温蛋白质中显著偏低。6、氨基酸残基的坚实装配蛋白质结构中存在有空隙。按照Chothia说法，蛋白球体积的大约25%仍未充满，即不是被氨基酸占据。但溶质分子可以包埋在这些孔隙中。这些孔隙通常为水分子所充满。分子量为2

4、―3万的蛋白质中约有个5―15水分子。由布朗运动调节的极性水分子与球体疏水核的接触会导致蛋白质不稳定。随着水分子从孔隙中除去，蛋白质结构变得更坚实，蛋白质的稳定性也增加。因此，蛋白质的坚实化可作为一种人为稳定蛋白质的方法。7、疏水相互作用带有非极性侧链的氨基酸大约占蛋白质分子总体积的一半。它们与水的接触从热力学上来说是不利的，因为非极性部分加入水中，会使水的结构更有序地排列。水分子的这种结构重排，显然能引起系统的熵降低和蛋白质折叠状态的改变：蛋白质的非极性部分总是倾向于使其不与水接触，并尽可能地隐藏在蛋白球体内部。从而蛋白质稳定性增加。第二节蛋白质不可逆失活的原因

5、和机理失活机理变性条件聚合（有时伴随形成分子间二硫键）加热，变性剂脲，盐酸胍,SDS,振动一级结构改变1、酸、碱催化的肽键水解，蛋白水解作用和自溶作用极端pH值，加热，蛋白水解酶2、功能基氧化（半胱氨酸巯基和色氨酸吲哚环）氧气（特别在加热时）氧气代谢产物，辐射3、二硫键还原，分子间二硫交换加热，高pH，巯基化合物,二硫化物4、必需巯基的化学修饰金属离子，二硫化物5、蛋白质磷酸化蛋白激酶6、在催化过程中由于反应中间物（主要是自由基）引起的“自杀”失活底物7、氨基酸的外消旋化加热，极端pH8、二硫键剪切后形成新氨基酸（赖氨丙氨酸、）加热，高pH9、天冬酰胺脱氨加热，高

6、PH辅酶分子从活性部位上解离螯合剂、透析、加热，金属离子寡聚蛋白解离成亚基化学修饰，极端pH,脲，表面活性剂，高温或低温吸附到容器表面蛋白质浓度低,加热“不可逆”构象改变加热，极端pH,有机溶剂,盐酸胍流体中的剪切失活流体形变一、蛋白水解酶和自溶作用蛋白水解酶可催化肽键水解。当蛋白质底物也是一种蛋白水解酶时，就会发生自我降解现象，叫作自溶。二、聚合聚合分三步进行：N←U→A→As其中NU代表可逆伸展，A是聚合的蛋白质，As是发生了二硫交换反应的蛋白质聚合物。1、必须发生单分子构象变化，导致蛋白质可逆变性。这个过程使包埋的疏水性氨基酸残基暴露于水溶剂。2、这种三级结

7、构改变了的蛋白质分子彼此缔合，以最大限度地减少疏水氨基酸残基的不利的裸露。3、如果蛋白质分子含有半胱氨酸和胱氨酸残基，则会发生分子间二硫交换反应。与许多其它蛋白质失活原因不同，聚合并不一定是不可逆的。使用变性剂破坏分子间的非共价力（氢键或疏水相互作用）并且在无变性剂时，通过还原和再氧化再生天然二硫键，则有可能使蛋白质再活化。三、极端pH图4-6碱催化的β-消除反应破坏二硫键，产生新的分子内交联键（赖氨丙氨酸）。硫代半胱氨酸残基肽键水解也容易在强酸条件下或中等pH和高温相结合的条件下发生。在极端条件下（6mol/LHCI，24h,110℃）蛋白质可完全水解成氨基酸。

8、在强酸、中