动物微生物及免疫学(实践教学)实验报告.doc

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1、四川农业大学动物微生物及免疫学（实践教学）实验报告组长：**********组员：**********二零一二年四月一、实验目的（一）掌握一般培养基的制备原理及要求，掌握培养基酸碱度的测定，熟悉一般培养基的制备过程和各种器皿灭菌方法。（二）掌握细菌分离培养的基本要领和方法，掌握细菌抹片的制备方法和革兰氏染色法及油镜的使用方法，并认识革兰氏染色的反应特性。（三）掌握学习用微生物学原理诊断疾病的一般方法及步骤。一、实验用品（一）器材量筒、烧杯、电子天平、漏斗、三角烧瓶、空试剂瓶、玻璃棒、玻璃平皿、刻度吸管、pH试纸、纱布、脱脂棉、天平、电炉、试剂瓶瓶塞、扎绳、放大镜、包装纸、洗耳球、酒精灯、载玻片

2、、火柴、吸水纸、剪刀、记号笔、接种环、注射器、镊子、钳子、毫米尺、培养箱、水浴培养箱、高压蒸汽灭菌锅、油镜（二）试剂及材料肘胨、蛋白胨、猪胆盐、氯化钠、琼脂、乳糖、0.01%结晶紫水溶液、0.5%中性红水溶液、血清、胰化蛋白胨、酵母提取物、氢氧化钠、盐酸、牛血清、革兰氏染色液、蒸馏水、小白鼠、病猪内脏二、实验步骤（一）培养基的制备（所有用到的器皿都已121℃高压灭菌15~30min，倾注平板在无菌操作台内完成，并放在无菌操作台内）1、麦康凯培养基（1）组成：蛋白胨17g、肘胨3g、猪胆盐5g、氯化钠5g、琼脂17g、乳糖10g、0.01%结晶紫水溶液10ml、0.5%中性红水溶液5ml、蒸馏水

3、1000ml（1）方法：将蛋白胨、肘胨、猪胆盐和氯化钠溶解于400ml蒸馏水中，调节pH至7.2。将琼脂加入600ml蒸馏水中，并加入乳糖，加热熔化。将两液混合，分装于烧瓶内，用纱布、扎绳等捆好后，121℃高压灭菌15~30min。待冷却至50~55℃时，加入结晶紫和中性红水溶液，摇匀后倾注平板。注：结晶紫和中性红水溶液配好后需经高压灭菌。1、血清平板（1）组成：营养琼脂、牛血清（2）方法：将灭菌的营养琼脂加热熔化，冷却至45~50℃时，加入牛血清，并混匀，倾注平板。注：不得将牛血清一并加入后再灭菌。2、LB培养基（1）组成：胰化蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化钠10g、琼脂15g（2）方法

4、：在950ml蒸馏水中加入胰化蛋白胨、酵母提取物、琼脂和氯化钠，调节pH至7.4，加热熔化，分装于瓶中，用纱布、扎绳等捆好后，121℃高压灭菌15~30min。待冷却至50~55℃时，倾注平板。3、液体培养基（在LB培养基的基础上，装入大试剂瓶中，不加琼脂，不分装）（一）病料取材在病猪死亡后，首先用显微镜检查其末梢血液膜片中是否有炭疽杆菌存在，未发现，则立即用消毒的器械对其进行生理解剖，观察其病理特征现象，取出病猪的十二指肠、胃、肝脏三处的组织物，并注意组织的完整性，用储物袋密封保存。（二）细菌粗培养1、消毒灭菌：操作人员先用消毒水清洗手或戴好实验手套，再用消毒水对无菌操作台内桌面及用酒精灯外

5、焰对待用器械进行火焰灭菌。2、接种（1）在无菌操作台酒精灯旁打开用储物袋密封保存的病料，先左手持镊子右手持剪刀，把病料剪出一个小口。（2）右手持灭过菌的接种环，左手持平板，并用拇指、食指及中指将平皿揭开约20。左右，然后将接种环前端插入小口旋转一下后，再用划线接种的方法接种到一个血清平板上。（3）用记号笔在平板底部作好日期、操作人员、部位等标记，并将平板倒放。以此方法，分别接种十二指肠、胃粘膜、肝脏于血清平板上，各接种2个血清平板。3、培养：将接种好的血清平板倒扣放入37℃培养箱中，反向培养24小时。注：划线接种时尽量划开，以保证长出单个菌落，且划线时接种环应尽量倾斜，以免划破培养基（后同）；

6、待接种完毕后熄灭无菌操作台内酒精灯，关闭好无菌操作台窗口，打开无菌操作台内的紫外灯。（一）细菌纯培养1、菌落特征判断待粗培养的细菌培养24小时后，取出用放大镜观察记录单个小菌落的形态特征并用实验报告纸记录好，并在平板底部上做好观察标记，其形态特征包括大小、形状、菌落边缘、表面构造、隆起度、湿润度、透明度、颜色等。2、取单个菌落进行革兰氏染色镜检（1）取干净的载玻片，用记号笔在其一面做好正反面标记，再在载玻片另一面中央滴上一小滴蒸馏水。（1）将接种环在火焰上灭菌，待冷却后，在酒精灯旁从标记的单个小菌落中取少许细菌置于蒸馏水中混匀（同时盖好平板倒扣置于一旁），用接种环涂成直径约1.5cm的菌膜，再

7、在酒精灯火焰上方以钟摆速度通过固定好细菌，待冷却进行染色。（2）先滴加草酸结晶紫溶液染色1~2min，再水洗；然后滴加革兰氏碘液溶液染色1~2min，再水洗；随后滴加95%的酒精脱色30~60s，再水洗；最后滴加稀释的品红进行复染30~60s，再水洗；待干燥或吸水纸吸干后镜检。（3）将干燥的载玻片放在1000倍油镜下，滴加一滴松柏油进行镜检，观察其形态特征，判断细菌的种属。1、细菌接种培养（1）消