无菌检查法-中国药典2010第三部-附录XII.docx

《无菌检查法-中国药典2010第三部-附录XII.docx》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

1、附录XIIA无菌检查法无菌检查法系用于检查药典要求无菌的生物制品、医疗器具、原料、辅料及其他品种是否无菌的一种方法。若供试品符合无菌检查法的规定，仅表明了供试品在该检验条件下未发现微生物污染。无菌检查应在洁净度万级下的局部洁净度百级的单向流空气区域内或隔离系统中进行，其全过程应严格遵守无菌操作，防止微生物污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。单向流空气区、工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度验证。隔离系统应按相关的要求进行验证，

2、其内部环境的洁净度须符合无菌检查的要求。日常检验还需对试验环境进行监控。无菌检查人员必须具备微生物专业知识，并经过无菌技术的培训。培养基培养基的制备：培养基按以下处方制备，亦可用按该处方生产的符合规定的脱水培养基。配制后应采用验证合格的灭菌程序灭菌。制备好的培养基应保存在2~25℃避光的环境，若保存于非密闭容器中，一般可在3周内使用；若保存于密闭容器中，一般可在1年内使用。1、硫乙醇酸盐流体培养基酪胨（胰酶水解）15.0g酵母浸出粉5.0g葡萄糖5.0g氯化钠2.5gL-胱氨酸0.5g新配制的0.1%刃天青

3、溶液1.0mL硫乙醇酸钠0.5g（或硫乙醇酸0.3mL）琼脂0.75g水1000mL除葡萄糖和刃天青溶液外，取上述成分混合，微温溶解，调pH值为弱碱性，煮沸，滤清，加入水葡萄糖和刃天青溶液，摇匀，调pH值使灭菌后为7.1±0.2。分装至适宜的容器中，其装量与容器高度的比例应符合培养结束后培养基氧化层（粉红色）不超过培养基深度的1/2，灭菌。在供试品接种前，培养基氧化层的高度不得超过培养基深度的1/5，否则，须经1000℃水浴加热至粉红色消失（不超过20分钟）后，迅速冷却，只限加热一次，并防止被污染。2、改良

4、马丁培养基胨5.0g磷酸氢二钾1.0g酵母浸出粉2.0g硫酸镁0.5g葡萄糖20.0g水1000mL除葡萄糖外，取上述成分混合，微温溶解，调pH值约为6.8，煮沸；加入putaotang溶解后，摇匀，滤清，调pH值使灭菌后为6.4±0.2，分装，灭菌。3、选择性培养基按上述硫乙醇盐流体培养基或改良马丁培养基的处方及制法，在培养基灭菌或使用前加入适宜的中和剂、灭活剂或表面活性剂，其用量同方法验证试验。4、营养肉汤培养基胨10.0g氯化钠5.0g牛肉浸出粉3.0g水1000mL取上述成分混合，微温溶解，调pH值

5、为弱碱性，煮沸，滤清，调pH值使灭菌后为7.2±0.2，分装，灭菌。5、营养琼脂培养基按上述营养肉汤培养基的处方及制法，加入14.0g琼脂，调pH值使灭菌后为7.2±0.2，分装，灭菌。6、改良马丁琼脂培养基按改良马丁培养基的处方及制法，加入14.0g琼脂，调pH值使灭菌后为6.4±0.2，分装，灭菌。培养基的适用性检查无菌检查用的硫乙醇酸盐流体培养基及改良马丁培养基应符合培养基的无菌性检查及灵敏度检查的要求。本检查可在供试品的无菌检查前或与供试品的无菌检查同时进行。培养基的无菌性检查每批培养基随机抽取不少

6、于10支（瓶），5支（瓶）置30~35℃、另5支（瓶）置20~25℃培养14天，均应无菌生长。灵敏度检查菌种培养基灵敏度检查所用的菌株传代次数不得超过5代（从菌种保藏中心获得的冷冻干燥菌种为第0代），试验用菌种应采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。金黄色葡萄球菌（staphylococcusaureus）[CMCC（B）26003]铜绿假单胞菌（Pseudomonasaeruginosa）[CMCC（B）10104]枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）[CMCC（B）63

7、501]生孢梭菌（Clostridiumsporogenes）[CMCC（B）64941]白色念珠菌（Candidaalbicans）[CMCC（F）98001]黑曲霉（Aspergillusniger）[CMCC（F）98003]菌液制备接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中或营养琼脂培养基上，接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，30~35℃培养18~24小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中或改良马丁琼脂培养基上，20~25℃培养24~48

8、小时，上述培养物用0.9%氯化钠溶液制成每1mL含菌数小于100CFU（菌落形成单位）的菌悬液。接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂培养基上，23~28℃培养5~7天，加入3~5mL无菌的含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用无菌的含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%氯化钠溶液制成每1ml含孢子数小于100CFU的包子悬液