转座子的插入突变及转座子的应用课件.ppt

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1、转座子的插入突变及转座子的应用主讲人:杨长友本组成员:杨菊孙青芝陈骊君陆朝军杨长友内容提要一、转座子的发现二、转座子的分类三、转座子的转座机制四、转座子的遗传效应五、转座子插入位点的鉴定方法六、转座子的应用一、转座子的发现转座子(transponson,简称Tn),又称易位子,是指存在于染色体DNA上可以自主复制和位移的一段DNA序列。转座子可以在不同复制子之间转移,以非正常重组方式从一个位点插入到另外一个位点,对新位点基因的结构与表达产生多种遗传效应。一、转座子的发现转座子是1951年美国玉米遗传育种学家Mcclintock最早发现的,是针对玉米籽粒

2、中色斑不稳定现象而提出来的。当时这是一个新概念,它突破了以往人们认为基因在染色体上的位置是固定不变的认识,所以一开始并不被大家接受,直到1967年在大肠杆菌(E.coli)的半乳糖操纵子研究中发现了这类插入序列,才得以被普遍认同。一、转座子的发现现在的研究说明,在生物界中转座子是普遍存在的,并认为在生物的遗传进化方面有重要作用。转座子从一个位置转座到另一个位置的转入和切出过程,改变了原有基因的结构和排序,从而产生了突变。目前生物体中所发现的10%的突变是由于它抑制其他基因的表达而形成的。二、转座子的分类(一)简单转座子(插入序列,IS)结构特征:1、含

3、短的末端反向重复序列(15-25bp);2、含编码转座酶的基因;3、靶位点存在5-9bp的短正向重复序列。二、转座子的分类(二)复合转座子结构特征:(1)中间区域含编码转座酶以外的标记基因;(2)两端具有插入序列;(3)两末端是反向重复序列;(4)靶位点存在短正向重复序列。三、转座子的转座机制据转座子的移动机制,转座可分为:(一)复制型转座(二)非复制型转座(一)非复制型转座特征1、断裂和重接反应使靶重构。2、供体保持裂缺。3、不形成共整合体。(二)复制型转座特征:1、转座后原来位置上的转座因子保持不变;2、转座过程中有一共整合体。四、转座的遗传学效应

4、(1)插入突变失活或改变基因表达的模式。插入突变失活是转座的最直接效应,但转座也可以通过干扰宿主基因与其调控元件之间的关系或改变DNA的结构而影响基因的表达。四、转座的遗传学效应(2)插入位置上出现新的基因。(3)改变染色体结构。(见下图)(4)外显子改组当两个转座子被同一转座酶识别而整合到染色体的邻近位置时,则位于它们之间的序列有可能被转座酶作用而转座,如果这个DNA序列中含有外显子,则被切离并可能插入另一基因组中,这种效应称为外显子改组(exonshuffling)。外显子改组将导致基因组中新基因的产生。五、转座子插入位点的鉴定方法质粒拯救法反向P

5、CR法质粒拯救法该方法的操作步骤为,将转座子插入后形成的突变体的染色体或质粒DNA用限制性内切酶消化,凝胶电泳分离后,以转座子上的片段为探针,进行Southern杂交,确定转座子插入位点所在片段的大小,即在电泳分离条带上所处的位置。然后将这一部分DNA回收,连接在如pUC18等克隆载体上,转化大肠杆菌,并根据一定的基因标记筛选克隆有转座子插入位点的片段的菌株。质粒拯救法质粒拯救法是转座子应用于分子生物学研究后应用最广泛的转座子插入位点周围序列鉴定的方法。但这种方法实验周期比较长,操作相对繁琐,为保留选择标记,有时适宜的限制性内切酶的选取非常困难。对于一

6、个突变体中有多处转座子插入的研究以及需要鉴定的突变体数量众多的研究而言,这种方法不是一个理想方法。反向PCR法该方法的操作步骤为,提取转座子插入形成的突变体的染色体,用适宜的限制性内切酶消化后,用连接酶进行酶切片段的分子内自连,然后用一对位于转座子上的外向型引物进行PCR扩增,PCR产物直接测序或克隆在T载体上测序,获取转座子插入位点周围序列的信息。六、转座子的应用基因的标定构建突变体库鉴别菌株及群体多样性生态环境污染的生物修复转基因生物的克隆1、基因的标定所要分离和克隆的基因不同,在定位和标定时所用的方法也不同。若要获得感兴趣的己知目的基因,则采用目

7、的诱变策略,即用一个稳定遗传的隐性纯合体与一个带有活跃转座子的显性纯合体杂交,可以在F1代标定目的基因。1、基因的标定若要获得引起新突变的未知基因,则用随机诱变策略(非目的诱变),即将带有功能性转座因子的显性纯合系植株与不带转座因子的同种植株杂交,产生的F1子代再自交,在F2代中就可筛选到转座子随机插人引起突变表型的突变株,然后选择感兴趣的新突变株进行研究。2、构建突变体库转座子具有可选择的抗性标记而容易在体内鉴定突变,经转座子诱变的突变子含有已知的DNA片段,可以通过转座子序列的杂交来鉴定突变基因的位置,经转座子诱变的突变体具有高度的极性,使得被诱变

8、的基因以及同一操纵子内的下游基因完全丧失功能。2、构建突变体库正因为以上转座子的特征,转座子才

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