分子生物学课件：实验二 PCR产物T-A连接及连接产物转化.ppt

《分子生物学课件：实验二 PCR产物T-A连接及连接产物转化.ppt》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、实验二、PCR产物的T-A连接及连接产物转化第一部分：PCR产物的电泳及回收第二部分：PCR产物与T载体的连接（T-A连接）第三部分：连接产物的转化1.电泳样品制备：在50lPCR产物中，加入6ul上样液，混匀。（上样液：10×Loadingbuffer或6×Loadingbuffer）2.上样：将上述样品加入凝胶加样孔中。注意：上样DNAMarker。3.电泳：100伏，30分钟。实验第一部分PCR产物的电泳及回收GAPDHgene片段(746bp)750bp2000bp1000bp500bp250bp100bpMarke

2、r12？？4.PCR产物的电泳结果观察及分析GAPDHgene片段(746bp)750bp2000bp1000bp500bp250bp100bpMarker12（1）在UV灯下，用手术刀片将含DNA片段的琼脂糖凝胶切下，放入封口膜中；（2）将切下来的胶块，标记好姓名，-20℃冰箱中。（3）放在封口膜内直接挤压，用加样器吸取挤压后得到的液体。5.挤胶法回收PCR产物33A--AT-VectorTT55-33-DNALigaseTTRecombinantvector1.TaqDNA聚合酶：PCR产物的3’端突出一个A2

3、.商业化的T载体：在3’端多出一个TAA3.两者的互补碱基先退火结合(粘性末端连接)，然后连接酶在缺口形成磷酸二酯键。T-A连接原理：实验第二部分PCR产物与T载体的连接连接反应的关键:目的基因片段与载体的比例，一般片段与载体的比例为3:1（摩尔比）。注意事项：2.使用T-载体时，避免反复冻融，防止T的断裂丢失。如果目的片段与T载体连接后，主要以自身环化为主，要考虑‘T’可能已经丢失。1.按下列配方进行连接反应：回收的PCR产物（DNA片段）7lT-载体1l10XLigationbuffer1lT4DNAligase1

4、l终体积10lT-A连接的步骤：注：最后加入工具酶（T4DNAligase）2.轻弹管底混合，离心机甩一下。3.将连接反应管置25℃水浴20min。（1）原理：大肠杆菌在低渗CaCl2溶液的条件下，细菌变得膨胀而易于外源基因的导入。1.感受态细胞的制备（2）注意事项：（1）在冰上操作。（2）无菌操作。超净台的火焰附近是无菌区。枪头、微量离心管、试剂等均已高压消毒，并已经放置于超净台中。实验第三部分连接产物的转化将大肠杆菌在LB琼脂培养基上划线，置37oC孵箱培养12-16小时；从琼脂平板上挑取单菌落，接种于2mlLB培养基中

5、，37oC,225rpm水浴摇床中震荡培养12-16h；取1ml上述培养物接种于100mlLB培养基中，37oC,225rpm水浴摇床中震荡培养，直至OD值为0.5左右(约3小时)。取1ml菌液，冰浴5min；6000rpm离心3min，弃上清，轻轻弹匀菌体沉淀，加入500μl冰冷的100mmol/LCaCl2致敏液悬浮细胞，冰浴5分钟；重复步骤5，感受态细胞制备完毕。感受态细胞在4oC可保存1周；若长期保存：加甘油至终浓度15%，分装后置-70oC。（3）操作步骤：10l连接产物可以进行1~4次转化。转化时一般要加入少量的

6、DMSO，作用：防止细胞被胀破、提高转化效率。热休克作用原理：Ca2+诱导大肠杆菌成为感受态细胞，感受态细胞经热休克（42oC，45～60s）发生收缩作用，使细胞膜出现空隙，细胞外的DNA进入细胞。2.连接产物的转化实验第三部分连接产物的转化在冰上，向感受态细胞中加入3lDMSO，轻弹管底混匀。再加入10l连接反应液，温和混匀。置冰上10分钟；42oC，45秒。然后迅速放回冰中5分钟；将转化后细菌加入到1mlLB培养液中；37oC,225rpm摇床中震荡培养30min；6,000rpm离心20s，弃掉800l上清,用剩余

7、液体重悬菌体；将上述菌液涂匀于含有Amp的LB琼脂培养板；待菌液被平板吸收后，将平皿倒置于37oC孵箱中培养12-16h。播放录像:1、2。操作步骤：思考题：影响T-A连接效率的因素有哪些？感受态细胞制备、转化过程中的主要注意事项是什么？转化后的平皿为什么需要倒置培养？实验结束：整理实验台；值日生值日；写实验报告。