分子生物学课件：2016-09 常用分子生物学技术的原理及其应用2.ppt

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1、第二十章.常用分子生物学技术的原理及其应用第二节DNA序列测定DNASequencing---DNA链中，核苷酸A,C,G,T的排列顺序---DNA序列的书写方向:5’-3’5’-TGATCGAGCGTA-3’DNA序列?一、DNA序列分析有双脱氧链终止法和化学裂解法（一）Sanger双脱氧链终止法利用2’，3’-双脱氧核苷酸掺入终止聚合反应（二）Maxam-Gilbert化学裂解法利用化学试剂裂解修饰碱基(dideoxychain-terminationmethod)Answer:Only1c

2、hainisamplified：ssDNA;Thechaincontainstheprimer.这也叫不对称PCR。背景知识1：Whatwillhappenifweaddonly1primerinPCRreaction?Sanger双脱氧链终止法背景知识2：PCR反应的底物：dNTP,ddNTP双脱氧核苷酸(ddNTP)单脱氧核苷酸(dNTP)3’-5’磷酸二酯键不能延伸!M1).In1primerPCR,asequencingprimerisannealedtoaDNAtemplateanda

3、DNApolymeraseextendstheprimerusingdNTPs.2）IfaddNTPisincorporatedintoextendingchain,thereactionwillbeterminatedbecauseddNTPhasno3-OHonthedeoxyribose.OHHdNTPddNTPDNA聚合酶TemplatePrimerNewstrand*以不对称PCR技术为中心，*利用双脱氧核苷酸终止新链的延伸，*从而获得在任何一个核苷酸上随机终止的一系列长度不同的DN

4、A片段。*变性聚丙烯凝胶电泳分辨仅差一个核苷酸长度的DNA片段只标记dATP。需做4个反应管，每个反应管含有一种ddNTP。每一个反应代表一种末端。GATC测序反应电泳AACGTGGACTAACGTGGACAACGTGGAAACGTGGAACGTGAACGTAACGAACAAA5'3'正极负极ddGddAddTddC荧光标记四种ddNTP，只需做一个反应。precipitatedinethanoltoremovetheremaindyesandthenloadonthemachineLasera

5、ctivatefluorescencedetectorM自动化的毛细管电泳SideViewDNA测序仪：其实它就是将测序PCR产物进行PAGE，电泳时激发出四色荧光，并进行软件分析。二、DNA序列分析可以揭示基因和基因组一级结构变化（一）通过DNA序列分析可以鉴定基因和基因组的变异（二）通过DNA序列测定分析人工重组的基因（三）通过DNA序列测定对定点突变进行确认第二节DNA序列测定DNASequencingSanger法进行DNA测序的基本原理二、DNA序列分析可以揭示基因和基因组一级结构变化

6、一、DNA序列分析有双脱氧链终止法和化学裂解法*ShortSummaryofthispart：ThankYou!