层析填料的选择及其装柱技术介绍幻灯片ppt课件.ppt

《层析填料的选择及其装柱技术介绍幻灯片ppt课件.ppt》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、层析填料的选择及装柱技术介绍佳辰公司生物中心陈阶2012-04-18如何选择填料？一、依据所纯化的对象的各物理和化学特性。（一般包括蛋白、酶、重组蛋白、单抗、抗体及抗原、肽类、病毒、核酸等）二、纯化所要达到的目的（粗提？中度纯化？精细纯化？）。三、所要选择的层析方法1.凝胶过滤(Gf)2.离子交换(IEX)3.亲和层析(AC)4.疏水层析(HIC)5.反相层析(RPC)四、填料自身的物理化学特性合理衔接不同层析技术IEXHIC粗样或样品含高盐GF脱盐GF脱盐GF脱盐ACIEXHIC或者需要稀释IEXGF或RPCG

2、F或RPCGFGF样品澄清粗提中度纯化精细纯化凝胶过滤如何选择填料？一、4种主要常用的凝胶类型葡聚糖凝胶：Sephadex（SephadexG中G值越小，交联度越大，吸水性越小）适合脱盐、buffer交换琼脂糖凝胶Sepharose（宽广的分离范围）聚丙烯酰胺凝胶sephacryl（Bio-Gelp）琼脂糖及葡聚糖组成的复合凝胶Superdex（高分辨率、高回收率，运行时间短）二．凝胶过滤填料的选择原则1．凝胶的交联度越高，孔径越小。2．对大分子物质的分离，多采用琼脂糖。3．对小分子物质的分离，多采用葡聚糖。4．

3、凝胶颗粒的粗细影响分离效果。SephadexLH-20为例SephadexLH-20是由葡聚糖G-25羟丙基化加工而成，属于分子筛凝胶，尤其适用于天然产物在有机溶剂中的纯化。例如：类固醇、萜类、脂类以及小分子多肽等。SephadexLH-20同时具备亲水和亲脂双重性质，且被分离物质的极性在分离过程中起着重要作用。PharmadexLH-20同时适用于分子类别非常相似的物质的分离和工业规模的制备，既可用于初步纯化步骤，也可用于最终精制步骤，如非对映同分异构体的分离。SephadexLH-20为例对于SephadexL

4、H-20而言，25～100μm的粒径范围相对于许多用于制备色谱的填料而言，不能说分布均一，也就是说其粒径分布较宽。然而当胶溶胀后就相对容易得到均一的柱床。这对于长柱（最高至250cm）而言也是同样的。在装柱前，层析柱和储槽都必须进行彻底的清洗。SephadexLH-20在使用之前必须进行溶胀。在溶胀的过程中，要尽量避免过分搅拌，否则会破坏球形胶粒，且要避免使用磁力搅拌器。1．在室温下，将凝胶溶胀于层析溶剂中至少三小时，溶胀后胶体积的大小决定于所使用的溶剂系统。2．使溶胀胶体积沉淀之后占总体积的75%，上层溶剂占25

5、%，这时，悬浮液从一个容器倒入另一容器时胶粒可移动。3．将溶胀后的凝胶根据装柱要求均匀倒入柱内，在保证胶粒不变形的前提下，应在尽可能高的压力下装柱，反压不要超过1.5ba。（考虑到损耗，称量SephadexLH-20干胶138g（柱体积589.05ml），放入2000ml的烧杯中，加入双蒸水1200ml并在沸水浴中将湿凝胶逐渐升温至近沸10分钟，随后取出，室温静置3小时以上，直到温度降为室温。）溶剂溶胀系数（溶胀体积ml/干胶g）吸收能力（吸收溶剂体积ml/干胶g）水4.0——4.42.1DMSO4.4——4.6-

6、--乙醇3.6——3.91.8离子交换层析如何选择填料？根据被分离物质分子表面电荷性质进行吸附解吸附。离子交换层析如何选择填料？离子交换层析如何选择填料？利用被分离的（生命大分子）物质和特异性配体之间能可逆性结合与解离的原理而建立的层析方法。分类：特异性配体亲和层析：配体一般为复杂的生命大分子物质（如抗体、受体、酶的类似物等）。其特点是吸附特异性强，结合力大通用性配体亲和层析：配体一般为简单的小分子物质（如金属、染料、氨基酸等）。其成本低，具有较高的吸附容量，但分辨率不及前者亲和层析亲和层析如何选择填料？（亲和吸

7、附介质：基质+配体）一、基质的选择理想的基质应符合下面的要求：1．极低的非特异性吸附。2．高度的亲水性。3．较好的理化稳定性。4．大量的化学基团能被有效地活化，而且容易和配体结合。5．适当的多孔性。一般亲和吸附剂采用的基质有纤维素、聚丙烯酰胺凝胶、交联葡聚糖、琼脂糖、交联琼脂糖、多孔玻璃珠等。常用亲和吸附剂采用的基质一般有纤维素、聚丙烯酰胺凝胶、交联葡聚糖、琼脂糖、交联琼脂糖以及多孔玻璃珠等。商品纤维素：具有非特异吸附性，且本身结构不均一聚丙烯酰胺凝胶和交联葡聚糖：与配体结合后，多孔性会大大降低，且聚丙烯酰胺凝胶具

8、有大量酰胺键，不易在载体与配体之间引入间隔物玻璃珠：具有多孔性好，机械性能强等优点，但对有的物质也有一定的吸附力目前使用最广泛的是Sepharose4B，它是有D-半乳糖和3，6-脱水-L-半乳糖结合成的链状多糖，极易用溴化氰活化，并易于引入不同基团；在温和条件下可连接较多的配体，容易吸附大分子物质，且吸附容量较大二、配体的选择理想的配体应具有以下一些性质：