免疫荧光细胞化学技术课件.ppt

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1、第四章免疫荧光细胞化学技术免疫荧光细胞化学技术(immunofluorescencecytochemistry)采用荧光素标记的已知抗体或抗原作为探针，检测待测细胞或组织内的靶抗原或抗体，形成带有荧光素的抗原抗体复合物。利用荧光显微镜观察标本，根据组织细胞中荧光物质的存在，确定抗原或抗体的性质并定位，以及利用定量技术测定含量。荧光抗体法：用荧光抗体示踪或检查相应抗原的方法。较常用荧光抗原法：用已知的荧光抗原标记物示踪或检查相应抗体的方法。荧光抗体法+荧光抗原法=免疫荧光细胞（组织）技术免疫荧光细胞化学技术包括荧光抗体法和荧光抗

2、原法免疫荧光细胞化学方法：直接法、间接法、补体法免疫荧光染色标本制备：涂片、印片、细胞单层培养物、组织切片……经适当固定后染色，或不固定直接染色。存档蜡块：不能再用以免疫荧光染色存档的HE染色标本：褪去盖片和颜色，再作免疫荧光或其它免疫细胞化学的染色。主要内容一、荧光的特征二、荧光素三、荧光素标记抗体的方法四、荧光抗体的质量鉴定五、免疫荧光组化染色方法六、荧光显微镜七、非特异性荧光的消除方法八、免疫荧光细胞化学的对照染色九、激光扫描共聚焦显微镜一、荧光的特征分子都含有电子，电子在不停地运动着。根据量子理论，运动着

3、的电子可以处于一系列不连续的能量状态中，电子遵守一定的规则，要以从一个能级向另一能级跃迁，并伴随着与能级差相对应的特定能量的吸收或释放。激发:当电子吸收能量跃迁到较高能级，这个过程叫激发。发射:以辐射方式跃迁时，能量转化成相应波长的光，这个过程叫发射。荧光(fluorescence)跃迁到激发态的电子，大多处于单重激发态。如果电子直接从单重激发态以辐射方式跃迁到基态，由于单重激发态很不稳定，半衰期很短，发射持续的时间也很短，这种发射光，叫荧光。即指一个分子或原子吸收了给予的能量后即刻引起发光，停止能量供给，发光也瞬时停止(一般

4、持续lO-7～lO-8s)。二荧光素能够产生荧光并能作为染料的化合物称为荧光素；必须具备：吸收激发光的光能并发射荧光。1具备用于标记抗体的荧光素条件(1)应具有与蛋白质分子形成共价键的化学基团，结合后不易离解，而未结合的色素及其降解产物易排除。(2)荧光效率高，与蛋白质结合后荧光素质量下降不多。(3)标记后对抗体的免疫学性质和生化性质无影响。(4)结合方法简便而快速，并且较稳定。(5)荧光素容易溶解，溶解后不会和其他物质发生化学反应。(6)荧光颜色与背景组织的自发荧光颜色对比鲜明，能清晰判断结果。(1)异硫氰酸荧光素(FITC

5、)呈黄色、橙黄或褐黄色粉末或结晶，性质稳定，在室温下能保存2年以上，在低温中可保存多年。易溶于水和酒精。呈现黄绿色荧光。在碱性条件下，FITC的异硫氰酸基在水溶液中与免疫球蛋白的自由氨基经碳酰胺化而形成硫碳氨基键,成为标记荧光免疫球蛋白，即荧光抗体。一个IgG分子最多能标记15-20个FITC分子2荧光素的种类：最大吸收光谱：490～495nm，最大发射光谱：520～530nm。分子量：389.4KD(2)四乙基罗达明(RB200)褐红色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮，性质稳定，可长期保存。呈明亮橙红色荧光。RB200在五氯

6、化磷(PCl5)作用下转变成磺酰氯，在碱性条件下易与蛋白质的赖氨酸一氨基反应结合而标记在蛋白分子上。最大吸收光谱:570nm最大发射光谱:596～600nm分子量：580KD(3)四甲基异硫氰酸罗达明(TMRITC)紫红色粉末，罗达明的衍生物，易溶于水，性质较稳定。呈橙红色荧光，与FITC的黄绿色荧光对比清晰，与蛋白质结合方式同FITC。它可用于双标记示踪研究。最大吸收光谱:550nm最大发射光谱:620nm(4)4-乙酰胺-4-异硫氰酸-2-硫酸芪（SITS）---蓝色荧光(5)得克萨斯红（Texasred）(6)藻红素R(

7、7)花青（Cyanine,Cy2绿色,Cy3红色,Cy5）…三、荧光素标记抗体的方法(一)FITC标记抗体的方法1Marsshall法(1)原理：当FITC在碱性溶液中与抗体反应时，主要是抗体分子上的赖氨酸-氨基与FITC上硫碳胺键结合，一个IgG分子中有86个赖氨酸残基，一般最多能结合15～20个。荧光素FITC-N＝C＋N-蛋白质→FITC-N–C–N-蛋白质‖‖SHHHSH(2)操作流程抗体与荧光素比例为50-100:1抗体的准备：20mg/ml(抗体+生理盐水+碳酸盐缓冲液）碳酸盐缓冲液为总量的1/10。荧光素的准备

8、：根据欲标记的蛋白总量，每毫克加入0.01mgFITC结合（标记）：边搅拌边将称取的荧光素加入抗体溶液中（5-10min)。避免粘于瓶壁或搅拌棒上，继续搅拌12-18h，4℃透析：离心去沉淀，装入透析袋pH8.0缓冲盐水透析过夜，0-4℃过柱：葡萄糖凝胶G50或G25柱分离游