核酸检测实验室的规范化管理.ppt

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1、核酸检测实验室的规范化管理一、规范化设置及管理(一)临床基因扩增检验实验室区域设置原则1．临床基因扩增检验实验室原则上分为四个分隔开的工作区域：试剂贮存和准备区；标本制备区；扩增反应混合物配制和扩增区；扩增产物分析区。（如使用全自动分析仪，区域可适当合并）2．各工作区域必须有明确的标记，避免不同工作区域内的设备、物品混用。3．进入各工作区域必须严格按照单一方向进行，即：试剂贮存和准备区标本制备区扩增反应混合物配制和扩增区扩增产物分析区。4．不同工作区域使用不同的工作服(例如不同的颜色)。工作人员离开各工作区域时，不得将工作服带出。（二）工作区域仪器设备配置标准1．试剂贮存和准备区2

2、-8℃和-15℃冰箱；混匀器；微量加样器(覆盖1--1000μl)；移动紫外灯(近工作台面)；消耗品：一次性手套、一次性吸水纸、耐高压处理的离心管和加样器吸头(带滤芯)；专用工作服和工作鞋；专用办公用品。2．标本制备区1-8℃冰箱、-20℃或-80℃冰箱；高速台式冷冻离心机；混匀器；水浴箱或加热模块；微量加样器(覆盖1--1000μl)；可移动紫外灯(近工作台面)；超净工作台；消耗品;一次性手套、一次性吸水纸、耐高压处理的离心管和加样器吸头(带滤芯)；专用工作服和工作鞋；专用办公用品；如需处理大分子DNA，应备有超声波水浴仪。3.扩增反应混合物配制和扩增区核酸扩增仪；微量加样器(覆

3、盖1--1000μl)；可移动紫外灯(近工作台面)；消耗品（一次性手套、一次性吸水纸、耐高压处理的离心管和加样器吸头(带滤芯)；专用工作服和工作鞋；专用办公用品.4.扩增产物分析区基本仪器设备如下：微量加样器(覆盖1--1000μl)；可移动紫外灯；消耗品；专用工作服和工作鞋；专用办公用品。（三）各区操作注意事项下述操作在该区进行：储存试剂的制备、试剂的分装和主反应混合液的制备。在本区的实验操作过程中，必须戴手套并经常更换。操作中使用一次性帽子也是一个有效地防止污染的措施。严禁用嘴吸取液体，加样器和吸头等必须经高压处理。工作结束后必须立即对工作区进行清洁。实验室及其设备的使用必须有

4、日常记录。1.试剂贮存和准备区2.标本制备区下述操作在该区进行：标本保存、核酸（RNA、DNA）提取、贮存及其加入至扩增反应管和测定RNA时cDNA的合成。为避免样本间的交叉污染，加入待测核酸后，必须盖好含反应混合液的反应管。对具有潜在传染危险性的材料，必须有明确的样本处理和灭活程序。样本处理对核酸扩增有很大影响，必须使用有效的核酸提取方法。3.扩增区下述操作在该区进行：DNA或RNA扩增。在巢式PCR测定中，通常第一轮扩增后必须打开反应管，因此巢式扩增由较高的危险性，第二次加样必须在本区内进行。不能从本区再进入任何“上游”区域，可降低本区的气压以避免气溶胶从本区漏出。为避免气溶胶

5、所致的污染，尽量减少在本区的走动。4.扩增产物分析区下述操作在本区内进行：扩增片段的测定。本区是最主要的扩增产物污染来源，因此必须注意避免通过本区的物品及工作服将扩增产物带出。本区有可能会用到某些可致基因突变和有毒物质如溴化乙锭、丙稀酰胺、甲醛或同位素等，应注意实验人员的安全防护。本区如采用负压或减压情况下可减少扩增产物从本区扩散至前面区域的可能性二、质量保证临床基因扩增检验实验室质量保证涉及到整个基因扩增检验所有阶段，即测定分析前的标本采集处理、测定中的核酸提取，扩增和产物分析以及测定后的结果报告等。（一）标本的采集（二）标本的稳定化处理（三）标本的运送（四）标本的贮存（五）标本

6、的处理(核酸提取)（六）靶核酸的逆转录CFIT)和扩增（七）污染（八）扩增产物的分析（九）质量控制（一）标本的采集常用于基因扩增检测的临床标本包括EDTA或构橼酸钠抗凝全血或骨髓、血清或血浆、痰、脑脊液、尿及分泌物等。采血液等样本时，应使用一次性密闭容器，如真空采血管。当使用非密闭采样系统时，如尿、分泌物和骨髓的采样，必须注意防止来自采样者的皮屑或分泌物的污染。采样时必须戴一次性手套。玻璃器皿在使用前应高压处理。临床用于RNA（如HCVRNA）扩增检测的血标本建议进行抗凝处理，并尽快（3小时以内）分离血浆，以避免RNA的降解。如未作抗凝处理，则抽血后，必须在1小时内分离血清。（二）

7、标本的稳定化处理用于DNA扩增检测的标本，应及时送至实验室。用于RNA测定的标本应进行稳定化处理，异硫氰酸胍盐(Guanidinethiocyanate，CITC)可使DNA酶和RNA酶立即失活，因此在采集标本时，可将标本材料如血清或血浆按1：4的比例加至含有5mol／LGITC的试管中，从而使血清(浆)中的RNA酶不可逆失活。（三）标本的运送标本采集后必须尽快送至实验室。经过稳定化处理的标本可在常温下邮寄运送。用于RNA检测的标本，如果未经稳定化处理，须速冻后，放在