第四章：(酶工程)-酶的提取与分离纯化ppt课件.ppt

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1、第四章酶的提取与分离纯化预处理（pretreatment）：包括固液分离和细胞破碎（分离胞内产物）等。初步纯化（roughfractionation）（提取）：除去与目的产物性质差异很大的杂质。高度纯化（finefractionation）（精制）：除去与产物性质相似的杂质。浓缩与干燥（concentrationanddesiccation）（成品加工）:使酶与溶剂分离的过程。酶纯化的基本原则：①建立一个方便灵敏的分析方法；②选择有效的纯化方法，尽可能减少纯化步骤；③常在低温（4℃）条件下进行纯化，以避免酶的变性。第一节细胞破碎（一）细胞壁组成细

2、胞壁的主要成分：细菌：肽聚糖(N-乙酰萄糖胺，N-乙酰胞壁酸)酵母：葡聚糖，甘露聚糖，蛋白质真菌:多糖（几丁质和葡聚糖）微生物革兰氏阳性细菌革兰氏阴性细菌放线菌酵母菌霉菌壁厚/nm15~5010~13同G+100~300100~250层次单层多层多层多层主要组成肽聚糖(40%~90%)多糖胞壁酸蛋白质脂多糖(1%〜2%)肽聚糖(5%~10%)脂蛋白脂多糖(11%~22%)磷脂蛋白质葡聚糖(30%~40%)甘露聚糖(30%)几丁质(1%~2%)蛋白质(6%~8%)脂类(8.5%~13.5%)多聚糖(80%~90%)脂类蛋白质各种微生物细胞壁的结构与

3、组成细菌细胞壁的结构酵母菌细胞壁的结构M—甘露聚糖；P—磷酸二酯键；G—葡聚糖（二）细胞破碎的方法机械法物理法化学法生物法（酶解）1.机械法：1）液体剪切：搅拌、匀浆。2）固体剪切：研磨，捣碎。2.物理法：1）超声波破碎法。2）渗透压突变法：高渗（蔗糖，高盐等）平衡后迅速转入低渗溶液或水中。3）冻融法：反复低温冰冻，室温融化。3.化学法应用各种化学试剂与细胞膜作用，使细胞膜结构改变或破坏。1）有机溶剂处理：破坏膜磷脂结构，常用丙酮、丁醇、氯仿等。2）表面活性剂处理：常用非离子型表面活性剂，如TritonX-100,Tween－80等。4.酶解法（

4、enzymaticlysis）：外加酶法：根据细胞壁的结构和组成特点，选用适当的酶。自溶法（autolysis）:细胞结构在本身具有的各种水解酶作用下发生溶解的现象。第二节酶的提取(extraction)把酶从生物组织或细胞中以溶解状态释放出来的过程，即将尽可能多的酶，尽量少的杂质从原料中引入溶液。提取目标：a.将目的酶最大限度地溶解出来。b.保持生物活性。注意：温度升高，溶解度加大。但为防止酶失活，一般采用低温下（0~10℃）操作。提取原则a.相似相溶。b.远离等电点的pH值，溶解度增加。提取方法：（一）盐溶液提取常用稀盐（常用NaCl）溶液（

5、盐溶），对酶稳定性好、溶解度大，最常用。（二）酸、碱溶液提取（三）有机溶剂提取影响酶提取的因素：酶在溶剂中的溶解度酶向溶剂中的扩散速度温度pH值提取液的体积第三节沉淀分离（根据溶解度的不同）使溶液中的溶质由液相转变为固相析出古老、实用、简单的初步分离方法在生物大分子制备中最常用的几种沉淀方法：⑴中性盐沉淀（盐析法）⑵有机溶剂沉淀⑶选择性沉淀（热变性和酸碱变性）⑷等电点沉淀⑸有机聚合物沉淀（一）盐析沉淀法（改变离子强度）1.基本原理（盐溶和盐析）向蛋白质或酶的水溶液中加入中性盐，可产生两种现象：1)盐溶（saltingin）：低浓度的中性盐增加蛋白

6、质的溶解度。2)盐析（saltingout）：高浓度的中性盐降低蛋白质的溶解度。蛋白质的盐析硫酸铵对马血红蛋白的溶解度的影响离子强度盐析盐溶原因：高盐浓度下盐离子与蛋白质分子争夺水分子，除去蛋白质的水合外壳，降低溶解度而沉淀。不同蛋白质分子量、表面电荷不同，在不同盐浓度下沉淀，逐渐增大盐浓度，不同蛋白质先后析出，称分段盐析。蛋白质分子表面的疏水区域和荷电区域1）中性盐的选择常用（NH4）2SO4，其突出优点：a.溶解度大b.分离效果好c.不易引起变性d.价格便宜2.盐析用盐2)盐浓度的表示用饱和（溶解）度表示:溶液中饱和硫酸铵的体积饱和度＝溶液的

7、总体积3)调整盐浓度的方式a.饱和溶液法（添加饱和硫酸铵溶液）适用于：蛋白质溶液体积不太大，而达到的盐浓度又不太高时。配制饱和硫酸铵溶液所需添加饱和硫酸铵的体积可按下式计算：S2-S1V=V0————1-S2式中V,V0——分别为所需加入的饱和硫酸铵体积及原溶液体积S2,S1——分别为所需达到的硫酸铵饱和度和原来溶液的硫酸铵饱和度b.添加固体硫酸铵适用于：蛋白质溶液原来体积已经很大，而要达到的盐浓度又很高时。实际使用时，可直接查表（各种饱和度下需加固体硫酸铵的量）。调整硫酸铵溶液饱和度计算表盐析操作低饱和度：饱和溶液滴加法。易于迅速混合均匀，一般

8、终饱和度不超过40％。高饱和度：固体盐添加法。不会大量增加溶液体积。1）固体硫酸铵充分研细，温和搅拌中缓慢加入。2）冰箱中（4℃）放置过