第十章-基因工程菌发酵ppt课件.ppt

《第十章-基因工程菌发酵ppt课件.ppt》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、第十章基因工程菌的发酵基因工程是指在基因水平上，采用与工程设计十分类似的方法，根据人们的意愿，主要是在体外进行基因切割、拼接和重新组合，再转入生物体内，产生出人们所期望的产物，或创造出具有新的遗传特征的生物类型，并能使之稳定地遗传给后代。基因工程基因工程的核心技术是DNA的重组技术。除DNA重组技术外，基因工程还应包括基因的表达技术，基因的突变技术，基因的导入技术等。基因工程一般分为4个步骤：取得符合人们要求的DNA片段，这种DNA片段被称为“目的基因”；将目的基因与质粒或病毒DNA连接成重组DNA；把重组DNA引人某种细胞；把目的基因能表

2、达的受体细胞挑选出来。工程菌的获得确定目的产物，找出产该产物的细胞。将细胞破碎后提纯出全部信使RNA。这些信使中包含了该细胞内表达的所有蛋白质的合成信息。利用基因扩增技术（PCR），找出所需的目的基因。将目的基因连接到设计好的质粒载体，形成了重组DNA分子。将重组后DNA分子引入到受体细胞内，然后选择合适的培养条件使细胞繁殖。根据选择性标记，从菌落中筛选出目的基因的重组(工程)菌。工程菌具备的条件发酵产品是高浓度、高转化率和高产率的，同时是分泌型菌株。菌株能利用常用的碳源，并可进行连续发酵。菌株不是致病株，也不产内毒素。代谢控制容易进行。能

3、进行适当的DNA重组，并且稳定，重组的DNA不易脱落。基因工程菌发酵动力学基因工程菌发酵设备基因工程菌的高密度发酵和控制基因工程菌发酵的后处理技术基因工程菌的不稳定性及对策应用案例与分析基因工程菌发酵动力学基因工程菌发酵动力学模型分类基因工程菌培养过程的动力学模型理想情况：把细胞群体处理为一种溶质不考虑细胞结构，但各种细胞均一细胞之间不均一细胞内部多组分细胞之间无差异细胞内部多组分均衡生长均衡生长非结构模型结构模型平均细胞近似平均细胞近似非离散模型离散模型非离散、非结构模型（均衡生长模型）假设培养体系是均一的，忽略细胞间的差异和不同时期组成

4、及代谢特性的差异适于研究细胞群体代谢生长代谢规律离散非结构模型培养体系中的细胞被区分成许多不同的状态和功能类型，对培养过程中细胞存在明显差异的系统是适合的。结构非离散模型细胞被分散成多个不同功能的部分，各部分相互协调作用，对分析胞内代谢调控有应用价值。离散结构模型细胞培养过程的实际情况，模拟单个细胞内的生化反应体系，通过单细胞模型的不同组合建立高层次的离散结构模型1基因工程菌细胞的生长动力学模型以对数生长期为例,处于该时期的微生物生长的数学模型如下：其中为细胞数量为培养时间拜为比生长速率10.1.2基因工程菌培养过程中的动力学模型由上式可以

5、推导出可用以推算在间歇发酵中f值随世代数n的变化情况,这在基因工程菌株的发酵中是非常重要的参数,例如,假设从斜面培养到33000L发酵培养需要25代时间,25代后含质粒细胞还占多少,即f25为多少就是一个必需考虑到的问题。分析结果表明f值随p和的增大而减小。2外源基因的表达和控制机制提高质粒稳定性的目的是为了提高克隆菌的发酵生产率，但外源基因表达水平越高，重组质粒往往越不稳定。可采用两阶段培养法，即在发酵前期控制外源基因不过量表达，使重组质粒稳定地遗传；到后期通过提高质粒的拷贝数或转录、翻译效率使外源基因高效表达。1）可诱导性启动子在构建

6、表达载体时，可使用可诱导性的启动子，如：lac、trp、PL等在用含有这些启动子的克隆菌进行发酵生产时，可以选择培养条件使启动子受阻遏（抑制）到一定时期；然后去阻遏（诱导）使质粒高效表达。例如：利用3--吲哚乙酸可使trp启动子去阻遏2）温度敏感型质粒一些温度敏感型质粒在温度较低时质粒拷贝数较少，当温度升高到一定值时质粒大量扩增——脱缰质粒（runawayplasmid）如：pKN410在30℃时的拷贝数为20～50/E.coli细胞；在35℃时质粒大量复制。将-内酰氨酶基因接在其上，经热诱导后，酶活可扩增400倍。质粒的行为规律

7、与宿主、质粒本身外界环境等密切相关工程菌培养过程中会发现质粒丢失现象，严重影响外源基因产物的产量和质量3质粒的行为规律原因分配的不稳定性结构不稳定性质粒不同拷贝状态分配不稳定：这是由于在细胞分裂过程中质粒缺失分配到子细胞中而导致整个质粒丢失。结构性不稳定：由于重组质粒DNA发生缺失、插入或重排引起的质粒结构变化。质粒保持率为考察质粒稳定性，在此引入质粒保持率Fn的概念，Fn表示分批培养中细胞分裂n次后，培养液中基因工程细胞数与总细胞数的比值，即表达效率及质粒拷贝数控制在工程菌培养过程中，表达效率与质粒拷贝数有关。在质粒稳定基础上，应

8、尽可能提高细胞内质粒拷贝数。在工业生产中易于操作的方法是在培养的不同阶段，采用不同培养温度达到提高拷贝数目的，在前培养阶段采用低温，以减少细胞负荷，此时拷贝数较低，而比生长速率升