包埋前免疫电镜 - sibcbaccn.doc

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1、包埋前免疫电镜1.将细胞转移到1.5mLEP管中，PBS洗一遍，4000rpm离心2min。2.4%多聚甲醛+0.25%戊二醛室温固定，摇晃15min，PBS洗一遍。3.标记细胞内抗原：0.5%Triton/PBS,室温处理15min，然后PBS洗一遍。4.取含4%BSA的TBST和一抗，按20：1(一般条件下一抗浓度较Confocal提高10倍使用)混合，4℃过夜，室温摇晃4h。5.4%BSA的TBST清洗，5min×3次。6.取含4%BSA的TBST（同western）和二抗，按100：1混合，室温避光摇晃1h。7.TBST清洗，5min×6

2、次。8.ddH2O配制的2%OsO4后固定30分钟。9.PBS清洗3次，10min/次。10.乙醇梯度脱水，65%，75%，85%，95%，100%各15分钟。11.无水硫酸铜处理过的无水乙醇置换两次，每次15min。12.1:1无水乙醇/812树脂，室温抽气过夜。13.100%812树脂包埋，60℃聚合48h。14.切片（金标）厚度50nm。15.2%醋酸铀-柠檬酸铅双染色。16.透射电镜观察，拍片。