第5章沉淀反应ppt课件.ppt

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1、第五章　沉淀反应(precipitationreaction)指可溶性抗原与相应抗体在适当条件下发生特异性结合而出现的沉淀现象。沉淀反应+-形成肉眼可见的大的免疫复合物,反应慢。沉淀线或沉淀环的观察以及免疫比浊法中的终点法就是测定此阶段形成的复合物第一阶段第二阶段沉淀反应分两个阶段抗原抗体特异性结合，快速但不可见。免疫比浊法中的速率法就是利用此阶段测定免疫复合物形成的速率。沉淀反应的原理抗原与抗体反应多克隆抗体非常适用于免疫沉淀试验。单克隆抗体抗原表面只有一种表位，不易形成交联，单克隆抗体一般不适用于免

2、疫沉淀试验，抗原表面有2个以上相同的表位，单克隆抗体也可用于免疫沉淀试验。R型抗体：沉淀反应中多用。环状沉淀试验絮状沉淀试验单向扩散试验双向扩散试验对流免疫电泳、火箭免疫电泳、免疫电泳、免疫固定电泳液相沉淀试验凝胶沉淀试验免疫电泳试验沉淀反应分类免疫浊度试验免疫投射浊度测定免疫散射浊度测定第一节　液相沉淀试验（自学）液相沉淀试验是指可溶性抗原与抗体在含电解质的液体介质中反应，形成肉眼可见的沉淀物。经典的液相沉淀试验：絮状沉淀试验环状沉淀试验第二节　凝胶沉淀试验（gelphaseprecipitation

3、）指可溶性抗原和相应抗体在凝胶中扩散，形成浓度梯度，在抗原抗体相遇并且浓度比例适当的位置形成肉眼可见的沉淀线或沉淀环。常用的凝胶：琼脂、琼脂糖、葡聚糖或聚丙烯酰胺凝胶。原理凝胶孔径>3nm，抗原或抗体分子（<3nm）可在其中自由运动。分子越大，扩散越慢，可据此识别分子量的差异。当抗原抗体结合形成抗原抗体复合物，分子量在百万以上，则被网络在凝胶中，出现肉眼可见的沉淀物。凝胶沉淀试验的分类单向免疫扩散试验（singleimmunodiffusiontest）双向免疫扩散试验（doubleimmunodiff

4、usiontest）一、单向免疫扩散试验（一）原理待测抗原溶液在含有相应抗体的凝胶内自由扩散，在二者比例适当处出现白色沉淀环，沉淀环的大小与抗原浓度呈正相关。用一系列已知浓度的抗原标准品进行试验，绘制标准曲线作为标本中抗原定量的依据。（二）技术要点①用电解质溶液配制10g/L的琼脂糖凝胶，加热溶解后，放56℃水浴平衡温度；②琼脂糖冷至56℃后，加入一定量的抗体血清，充分混匀；③倾注琼脂糖板，琼脂糖厚2mm，凝固后打孔，孔径3mm，孔距10～12mm；④孔内定量加入待测抗原溶液或不同浓度的抗原标准品溶液；

5、⑤湿盒37℃，24～48h，测量沉淀环的大小。抗体+琼脂沉淀环抗原①倾注平板　②打孔　③加样　④放置37℃,24～48h观察沉淀环单向扩散试验（平板法）俯视图侧面图打孔抗体抗原单向扩散试验结果上排为5个不同浓度的参考品；下排为患者血清。1.Mancini曲线：大分子抗原（IgM）时间扩散＞48h，常数C＝Kd2普通坐标纸曲线C为抗原浓度，d为沉淀环直径，K为常数（三）数据处理T1为16～24h；T2为24～48h；T3为48h以上,可见T3为直线，T1为反抛物线Mancini曲线2.Fahey曲线：小分

6、子抗原（IgG,IgA）扩散时间24h常数logC=kd半对数坐标纸曲线C为抗原浓度，d为沉淀环直径，K为常数t1为16～24h；t2为24～48h；t3为48h以上,可见t1为直线，t3为反抛物线Fahey曲线（四）应用与评价本法为经典抗原定量技术，常用于IgG、IgA、IgM、C3、C4等血浆蛋白的定量测定。若将一定浓度的抗原加入凝胶中，也可检测抗体浓度，称为逆向免疫扩散试验（reversedimmunodiffusiontest），其主要用于荧光抗体、酶标抗体和抗血清中抗体蛋白含量的测定。操作简单

7、，无需特殊设备，重复性和线性均可信。但灵敏度稍差（1.25mg/L），耗时长，影响因素多。（一）原理：将抗原抗体分别加在凝胶板不同的对应孔中，两者在凝胶中自由扩散，在比例合适处形成白色沉淀线。（二）技术要点：平板玻璃上倾注一层均匀的琼脂糖薄层，凝固后打孔（成对或梅花形），孔径为3mm，孔间距在3～5mm之间，在相对的孔中加入抗原或抗体，放置湿盒37℃24～48h后，观察孔周围是否出现沉淀线。鉴定抗原抗体的最基本、最常见的方法之一二、双向扩散试验抗体抗原（三）影响因素1.抗原抗体特异性要强，否则将会出现交

8、叉反应，导致假阳性结果。2.抗原抗体比例要适当，二者比例适当时，出现一条清晰的纤细的沉淀线。若比例不适当沉淀线将变得宽而模糊，甚至不出现沉淀线，导致假阴性结果。3.温度低，抗原抗体反应慢；分子越大，扩散速度越慢，时间越长。4.琼脂板厚度也将影响实验结果。（四）应用与评价1.抗原或抗体的定性分析用已知抗体（或抗原）检测未知抗原（或抗体）。2.抗体效价测定在梅花形孔的中央孔放定量抗原，周边孔放不同稀释度的相应抗体，以出现沉淀线的抗体最高稀释倍数