乙醇对小鼠原代肝细胞脂肪酸氧化速度影响.doc

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1、【摘要】目的建立小鼠肝细胞的体外培养方法，同时检测乙醇对肝细胞脂肪酸β-氧化速度的影响。方法采用戊巴比妥麻醉小鼠，通过肝脏灌注和胶原酶消化分离小鼠肝细胞，接种于胶原包被的培养皿中进行体外培养。通过HE染色观察细胞的生长状态。在20mmol/L乙醇存在的情况下，通过3H标记的棕榈酸（C16:0）检测肝细胞的脂肪酸氧化速度。结果成功地分离了肝细胞，肝细胞的存活率≥95%。肝细胞在体外培养48h仍能够保持良好的生长状态。对肝细胞脂肪酸氧化速度的研究发现，20mmol/L酒精能够导致肝细胞的脂肪酸氧化速度降低40%左右，导致肝细胞中脂肪含量增加。结论本研究成功地建立肝细胞的体外培养方法，采用

2、3H标记的脂肪酸能够敏感地检测脂肪酸氧化速度，而研究发现乙醇能够抑制肝细胞脂肪酸氧化速度。同时，本研究结果为肝细胞的脂肪和糖类代谢的研究提供了实验条件。【关键词】乙醇；肝细胞；脂肪酸Theeffectofethanolonfattyacidoxidationofmiceprimaryhepatocytes【Abstract】ObjectiveToisolatethemiceprimaryhepatocytes，andthecellswereculturedinvitro.Theinfluenceofethanolonfattyacidβ-oxidationvelocitywasmea

3、sured.MethodsThemousewasanesthetizedwithpentobarbital，andtheliverwasdegestedwithcollagenase.Theprimaryhepatocyteswereinoculatedincollagen-coateddishes.ThemorphologyofculturedprimaryhepatocyteswasobservedbyHEstaining.Thefattyacidβ-oxidationwasmeasuredusing［9，10-3H］palmiticacid(C16:0)asatracer.Re

4、sultsTheprimaryhepatocyteswereisolatedandculturedsuccessfully，andtheviabilitywasmorethan95%.20mmol/Lethanolcouldreducethespeedoffattyacidβ-oxidationabout40%，andleadtotheincreasedlipidlevelinhepatocytes.ConclusionWeisolatedandculturedthemouseprimaryhepatocytesinvitro，andtheinfluenceofethanolonfa

5、ttyacidβ-oxidationwasdetermined.Thisstudyishelpfulfortheresearchonthelipidmetabolisminliver.【Keywords】ethanol;hepatocyte;fattyacid肝脏在脂肪、糖和蛋白质的代谢过程中具有重要的作用。在体内肝细胞的代谢受到各种因素的影响。酒精在人肝细胞中主要由乙醇脱氢酶和过氧化氢酶代谢成具有细胞毒性的乙醛，然后由乙醛脱氢酶代谢为乙酸。在这个过程中，肝脏的糖脂代谢将受到影响。本研究通过体外分离肝细胞和培养，研究乙醇对肝细胞的脂肪酸氧化速度的影响。1材料与方法1.1材料C57BL

6、/6小鼠由第四军医大学实验动物中心提供；戊巴比妥钠、胶原酶、胰岛素、异丙肾上腺素，棕榈酸为Sigma公司；［9，10-3H］Palmiticacid为AmershamBioscience产品；Hisafe3闪烁计数液为PE公司产品。[!--empirenews.page--]1.2肝细胞的分离取C57BL/6小鼠，采用戊巴比妥钠（100mg/kg）麻醉；打开小鼠腹腔，向左侧移开小肠，暴露下腔静脉和门静脉，使用3号丝线从肾静脉近端绕过下腔静脉；采用21号套管针从下腔静脉传入，直至接近肝静脉；用丝线固定套管针，采用含有1mMEGTA和0.1%葡萄糖的Kreb-Ringer缓冲液灌注肝脏，

7、同时迅速切断门静脉使灌注液从门静脉流出，灌注压力为20cm水柱，灌注速度为4ml/min；灌注20ml后更换含有0.5mg/ml胶原酶和5mMCaCl2的灌注液继续灌注10min，立刻小心取出肝脏，置于含有Kreb-Ringer缓冲液的10mM培养皿中，用剪刀剪开肝脏包膜，轻轻晃动使肝细胞释放出来；采用70μm的细胞滤器过滤；使用10%FBS的DMEM洗涤细胞2次，50×g离心。1.3存活性鉴定分离后的肝细胞立刻用4%台盼蓝染色，在显微镜下观察，核呈蓝色为