透明颤菌血红蛋白研究现状及其在中药中科学应用展望.doc

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1、【关键词】透明颤菌属[关键词]透明颤菌属;血红蛋白类;基因;转基因  CurrentresearchstatusofVitreoscillahemoglobinandtheprospectiveapplicationintraditionalChinesemedicine  KEYWORDSVitreoscilla;hemoglobins;genes;transgenes  氧传递直接或间接影响着需氧生物的初级代谢和次级代谢。在哺乳动物中,血红蛋白具有氧结合特性,过去曾认为这种氧结合蛋白只存在于哺乳动物中,近期发现,它几乎普遍存在

2、于动物、植物和微生物中[1]。透明颤菌血红蛋白(Vitreoscillahemoglobin,VHb)是由透明颤菌属(Vitreoscillasp.C1)中产生的一种可溶性血红蛋白,这种血红蛋白能在贫氧条件下被大量诱导合成,使透明颤菌在微氧条件下能够很好地生存。随着研究的深入,发现该基因的表达在转录水平上受氧浓度调控。因此在以溶氧为限制条件的生物反应器中,尤其是在大规模、高密度微生物发酵和动植物细胞培养解决供氧问题领域具有潜在的应用前景。  1VHb的结构及特性  透明颤菌是一种专性好氧的革兰氏阴性丝状菌,属于贝日阿托氏菌属(Be

3、ggiatoe),在沼泽、腐烂植物等贫氧的环境中生长旺盛。VHb在透明颤菌中被发现,最初被认为是“细胞色素o(cytochromeo,Cyo)”蛋白,具有末端氧化酶的性质[2]。Cyo在不同的环境条件下可呈现三种不同的状态,即氧化态、还原态、氧合态,并可以相互转化;其中还原态是生理活性态,而氧合态则是富氧条件下的表现形式。它在577、544和420nm处有最大吸收峰,若向溶液中鼓入CO气体,则可形成蛋白CO复合物,在566、535及419nm处呈现特征吸收峰[3]。但是随着1983年真正的Cyo的分离和确定[4],实验表明该蛋白在

4、光谱学和氧结合动力学性质上与氧合肌红、血红蛋白相似[3,5]。1986年,Wakabayashi等[6]结合蛋白质初级结构、光谱性质、氧结合动力学确定了该蛋白的结构,并将该蛋白正式命名为透明颤菌血红蛋白。VHb为同型二聚体,带有两个相对分子量为15775的亚基,每个亚基含有146个氨基酸残基和两个b型血红素[7]。完整的VHb是可溶性的,但是脱去血红素辅基便不可溶。序列分析表明,VHb与其它真核生物蛋白氨基酸有明显的同源性,其中与黄羽扇豆血红蛋白(YellowlupinLegHb)的同源性最高,达到24%[8]。真核生物的血红蛋白

5、形成8个α螺旋区(A、B、C、D、E、F、G和H),而VHb每个亚基形成6个α螺旋区(A、B、E、F、G和H)。X射线晶体学表明VHb在近端和远端有独特的血红素端囊[7],初步认为受E螺旋和F螺旋的干扰所致,通过氢键和TyrB10、GlnE7、ProE8及LysE11四个残基形成此结构。大多数种类的血红蛋白都有一个末端的His(E7)残基,该His残基通常通过氢键与氧结合。而VHb端囊的E7位置为Gln残基。定点突变表明,GlnE7His突变对VHb立体结构影响很大,野生型VHb解离常数比GlnE7His突变型蛋白大很多,因此,V

6、Hb与被束缚的氧亲和力小,从而使氧的传递速度更快[9,10],这与晶体学研究结果一致。而在N端存在某些结构差异,少了α螺旋,这段序列曾被认为可能是前导肽,影响VHb的分布,使活性VHb主要分布在细胞周质[11]。近期用电子显微镜对VHb在透明颤菌和大肠杆菌中分布的分析结果表明,VHb主要分布在细胞质中而不是细胞周质,作者还认为细胞周质中的VHb可能是VHb过量表达而被挤出的结果[12]。[!--empirenews.page--]  2VHb基因的克隆、表达与调控  20世纪80年代中期以前,学者们一直认为,可溶性Cyo在细胞呼吸

7、中作为一种终端氧化酶而起作用。1986年,Orii等[5]对VHb与O2及VHb与CO结合的动力学进行了讨论,指出VHb可能是作为O2载体和储存物而起作用的。1988年,Dikshit等[13]根据已报道的VHb氨基酸序列合成探针,与透明颤菌基因组DNA进行杂交,在透明颤菌血红蛋白基因(Vitreoscillahemoglobingene,vgb)可能位区,得到了含有vgb基因的1.4kb的DNA片段,且此vgb基因携带内启动子而不受载体启动子的控制;同年,Khosla等[14]也用类似方法克隆了vgb基因,在vgb重组大肠杆菌中

8、表达时,同样得出了vgb基因是以自身启动子启动表达的结论。他们还测定了vgb基因的核苷酸序列,结果与Wakabayashi[6]报道的VHb氨基酸序列十分吻合。  将vgb基因转入大肠杆菌中表达,VHb的量与环境中的氧含量有关,vgb基因启动子在微

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