第19章基因诊断ppt课件.ppt

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1、第19章基因诊断GeneDiagnosis人类疾病的原因内因:基因结构改变(基因突变)——点突变、插入、缺失、重排、易位、基因扩增基因结构多态性基因表达异常外因:病原体的侵入对于疾病的诊断依据:临床表现实验室诊断技术:细胞学检查生物化学代谢产物和酶的活性变化检查免疫学检验基因诊断细胞核DNA转录翻译mRNA蛋白质细胞膜血清学诊断基因诊断生化学诊断临床学诊断临床表现一、基因诊断概述(一)基因诊断的概念与特点(二)基因诊断的基本原理与临床意义(一)基因诊断的概念与特点1.概念:指利用分子生物学技术,从DNA或RNA水平

2、检测基因的存在、分析基因的结构变异和表达状态,对疾病作出诊断的方法和过程。基因诊断以DNA和RNA为诊断材料,DNA诊断RNA诊断2.基因诊断的特点:(1)直接检测基因,属病因诊断,针对性强;(2)特异性强、灵敏度高:由于基因诊断采用核酸分子杂交、聚合酶链反应等技术;(3)适用范围广:其应用的范围已从原先局限的遗传性疾病扩大到感染性疾病、肿瘤、心血管疾病等领域。(二)基因诊断的基本原理与临床意义1.基本原理:通过检测致病基因(包括内源基因与外源基因)的存在、量的多少,结构变化与否及表达水平是否正常,以确定被检查者是

3、否存在基因水平的异常变化,以此作为疾病确诊的依据。2.临床意义:对有表型出现的疾病作出明确诊断早期快速诊断确定个体对疾病的易感性疾病的分期分型、疗效监测、预后判断等二、基因诊断的常用技术与方法(一)基因诊断的常用技术(二)基因诊断的基本方法(一)基因诊断常用技术1.核酸分子杂交2.PCR(聚合酶链式反应)3.限制性酶切分析4.SSCP(单链构象多态性分析)5.DNA测序6.DNA芯片技术1.核酸分子杂交Southernblot——DNANorthernblot——RNADotblotInSituHybridizat

4、ion,核酸分子杂交的流程示意图待测核酸制备滤膜上核酸固化杂交去除未参与杂交的探针检测杂交信号制备探针核酸片段探针标记加入标记核酸探针探针的种类DNA探针:基因组DNA探针;基因探针cDNA探针:目前应用最广泛的寡核苷酸探针(Oligonucleotideprobes)RNA探针:不同的探针在应用中有各自的特点,但最重要的是探针的序列选择.而探针序列又是依据待测核酸序列选择的。对致病性微生物应选用其最保守、最特异的序列;对突变基因的检测,应用含有突变位点的序列或待测基因编码的mRNA序列。探针的标记物放射性标记物3

5、2P,35S,125I,3H非放射性标记物生物素,地高辛,荧光素,酶,金属SouthernblotNNTTNTT1、Southernblot:用于DNA检测,不但能检测出特异的DNA片段,还能进行定位和测定分子量,可用于基因的限制性内切酶图谱分析、基因突变分析等。2、Northernblot:杂交用于RNA检测,能对组织细胞中的总RNA或mRNA进行定性和定量分析。3、dotblot:既可检测DNA也或检测RNA,用于基因组中特定基因及其表达的定性和定量分析。缺点:特异性较低,不能鉴定所分析的基因分子量。4、原位杂

6、交:在组织、细胞和染色体水平作核酸定性和定量分析,并可定位。PCR是在试管内利用DNA聚合酶催化的反应反复进行同一段DNA片段合成的过程(二)PCR技术是基因诊断的一种基础技术PCR技术的优点特异性强灵敏度高操作简单、省时对待检原始材料质量要求低高效率的基因扩增技术聚合酶链反应(PCR)PCR多重PCR:多对PCR引物同时进行PCRPCR/SSCPPCR/ASO1、直接采用PCR技术进行基因诊断通过PCR技术扩增特异性的基因,可以确定病原生物基因是否存在或分析疾病相关的体内基因缺失或基因突变2、采用PCR产物的限制

7、性片段长度多态性分析(PCR-RFLP)PCR-RFLP就是利用PCR技术先将包含待测位点的DNA片段扩增出来,然后用识别该位点的限制性内切酶水解,根据限制性片段数量和长度作出诊断。3、采用PCR-ASO技术等位基因特异性寡核苷酸探针技术(ASO)原理:针对已知突变位点的基因,可以分别针对已知突变位点的序列,设计一对寡核苷酸探针,其中一条为野生型探针,与无突变序列互补,另一个为突变型探针,与突变序列互补。同时设计探针时,突变碱基应位于探针的中央,这样在严格控制杂交和洗脱条件下,只有完全互补的探针保留下来,形成稳定杂

8、交分子,而中央碱基与靶序列不匹配的探针则被洗脱。已知突变Gene部位和性质,合成寡核苷酸探针,32P标记,进行斑点杂交。NormalβΑGeneProbe——与正常ProbeβΑ杂交稳定MutationβSGeneProbe——与异常βS杂交稳定PCR-ASO技术等位基因特异性寡核苷酸探针(ASO)(Allele-specific-oligonucleoti

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