（征求意见稿）猪传染性胸膜肺炎放线杆菌2、7、12型三重PCR定型检测技术.docx

《（征求意见稿）猪传染性胸膜肺炎放线杆菌2、7、12型三重PCR定型检测技术.docx》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、ICS11.220B41     DB34安徽省地方标准DB34/XXXXX—XXXX     猪传染性胸膜肺炎放线杆菌2、7、12型三重PCR定型检测技术TriplexPCRdetectiontechnologyofActinobacilluspleuropneumoniaetype2,7,12点击此处添加与国际标准一致性程度的标识（征求意见稿）     XXXX-XX-XX发布XXXX-XX-XX实施安徽省市场监督管理局   发布DB/XXXXX—XXXX前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由安徽农业大学提出。本标准由安

2、徽省农业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：安徽农业大学，农业农村部猪肉质量安全控制重点实验室，安徽省动物疫病预防与控制中心，安徽华杰农牧科技有限公司，和县农业农村局，望江县畜牧兽医局，望江申江养殖有限公司。本标准主要起草人：孙裴，高亚飞，占松鹤，王军，陈祥国，赵家喜，王杰，王希春，李杰，刘江，王勇，徐前明5DB/XXXXX—XXXX猪传染性胸膜肺炎放线杆菌2、7、12型三重PCR定型检测技术1　范围本标准规定了猪胸膜肺炎放线杆菌2、7、12型三重PCR定型检测的设备和材料、分型程序、操作步骤、结果判定。本标准适用于猪胸膜肺炎放线杆菌2、7、12

3、型三重PCR定型检测。2　规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。DB34/T2997-2017猪传染性胸膜肺炎放线杆菌检验操作规程GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T27401实验室质量控制规范动物检疫GB19489实验室生物安全通用要求SN/T2025动物检疫实验室生物安全操作规范3　术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1　猪传染性胸膜肺炎放线杆菌2、7、12型Actinobacilluspl

4、europneumoniaetypes2,7,12猪胸膜肺炎放线杆菌属于放线杆菌属的一种细菌，根据脂多糖和荚膜多糖的抗原特异性可分为15个血清型，根据生长是否需要V因子又可把15个血清型分为生物Ⅰ型和生物Ⅱ型，生物Ⅰ型通常毒力更强。猪胸膜肺炎放线杆菌2、7、12型属于生物Ⅰ型，毒力强，危害大。4　试剂和材料除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯；实验用水符合GB/T6682规定中一级水的要求。所有试剂均用无DNA酶污染的容器分装。4.1　2×TaqPCRMasterMix：TaqDNA聚合酶、dNTPs、MgCl2、反应缓冲液等。4.2　引物：扩

5、增引物和测序引物序列见附录A表A.1。4.3　10×PCR缓冲液：200mmoI/LTris-HCl（pH8.4），200mmol/L氯化钾，15mmol/L氯化镁。4.4　琼脂糖凝胶。4.5　10mg/mL溴化乙锭（EB）。4.6　相对分子质量：2000bpDNAmarker。5DB/XXXXX—XXXX1.1　5×TBE电泳缓冲液：445mmoI/LTris，445mmol/L硼酸，10mmol/LEDTA(pH8.0）。使用时稀释为0.5×TBE电泳缓冲液。2　仪器和设备2.1　电热压力蒸汽灭菌器。2.2　电子天平：感量0.1g。2.3　恒温

6、震荡培养箱。2.4　冰箱：2℃～5℃，-20℃。2.5　高速冷冻离心机：最大转速14000r/min以上。2.6　天平：量程2kg，感量0.1g。2.7　pH计。2.8　涡旋振荡器。2.9　PCR扩增仪。2.10　电泳仪。2.11　凝胶成像系统。2.12　超净工作台。2.13　微量移液器：0.5µL～10µL、5µL～50µL、20µL～200µL、100µL～1000µL。3　样品的采集、运输和保存3.1　采样要求应符合SN/T1447的相关规定。3.2　采样工具棉拭子、试管、剪刀、镊子、注射器，经160℃干热灭菌2h。3.3　样品的采集3.3.

7、1　活体样品采集用无菌棉拭子伸入鼻腔采集分泌物，放入无菌试管中立即送往实验室供分离。3.3.2　组织样品的采集根据临床症状的不同采集典型病料。用剪刀、镊子无菌采集肺脏、肺门淋巴结、扁桃体等器官和鼻腔分泌物，并在死亡2h内完成。3.3.3　血样的采集制备用注射器无菌操作采集动物血，每头不少于10mL。无菌分离血清，分装，加盖密封后4～8℃保存。3.4　样品的运输与保存采集的样品应置于低温、密封的容器内运输。待检样品在2℃～8℃条件下保存不应超过24h；若不能在规定时间内送检的，可保存于饱和氯化钠溶液或30％甘油缓冲盐水溶液中，但保存不应超过72h。5

8、DB/XXXXX—XXXX1　操作步骤1.1　细菌分离、培养及鉴定猪传染性胸膜肺炎放线杆菌分离、培养及鉴定按照DB34/T